發(fā)布時(shí)間：2020-05-29 14:02

【摘要】：啟動(dòng)子是基因工程中的一把關(guān)鍵的鑰匙,它能夠決定外源基因的轉(zhuǎn)錄方式,選擇合適的啟動(dòng)子調(diào)控不同外源基因的表達(dá)在生物學(xué)研究中具有重要作用。組織特異性啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)外源基因在特定的部位高效表達(dá),同時(shí)還能避免組成型啟動(dòng)子帶來的營(yíng)養(yǎng)浪費(fèi)等缺陷。發(fā)掘合適高效的組織特異型啟動(dòng)子及其順式作用元件的解析是啟動(dòng)子研究工作中的重點(diǎn)。前期本實(shí)驗(yàn)室從W38型煙草中克隆得到了sm-Nvas啟動(dòng)子區(qū)域的序列,生物信息學(xué)分析及轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)該啟動(dòng)子與維管束發(fā)育相關(guān)。本研究旨在分析sm-Nvas啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)活性,鑒定sm-Nvas啟動(dòng)子的順式作用元件,發(fā)掘新的組織特異型高效啟動(dòng)子。本研究取得的結(jié)果主要有:(1)對(duì)sm-Nvas啟動(dòng)子進(jìn)行5’端缺失分析,以起始密碼ATG中的A為+1位點(diǎn),將sm-Nvas啟動(dòng)子-799區(qū)域分為20個(gè)長(zhǎng)度不同的5’端缺失片段,并替換p CAMBIA1301、p CAMBIA1302的35S啟動(dòng)子與報(bào)告基因融合,共構(gòu)建20個(gè)5’端缺失片段-GUS重組載體和20個(gè)5’端缺失片段-GFP重組載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將這40個(gè)重組載體遺傳轉(zhuǎn)化至W38型煙草中,得到陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株。(2)完成GUS組織化學(xué)染色及GFP熒光觀察,結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)sm-Nvas啟動(dòng)子屬于組織特異型啟動(dòng)子。所有得到的轉(zhuǎn)基因植株均能檢測(cè)到報(bào)告基因的表達(dá),sm-Nvas啟動(dòng)子-216區(qū)域足以驅(qū)動(dòng)外源基因在維管束組織中表達(dá),-216區(qū)域內(nèi)存在啟動(dòng)子核心元件和維管束組織特異表達(dá)元件。(3)報(bào)告基因表達(dá)量結(jié)果顯示sm-Nvas啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)活性遠(yuǎn)高于35S啟動(dòng)子,是一個(gè)維管束組織特異型強(qiáng)啟動(dòng)子。-402～-640區(qū)域表達(dá)量顯著增高,且-640區(qū)域驅(qū)動(dòng)活性最高,表明-402～-337區(qū)域存在一個(gè)能上調(diào)啟動(dòng)子活性的元件。-680～-640區(qū)域存在一個(gè)能下調(diào)啟動(dòng)子活性的元件,與上調(diào)啟動(dòng)子活性的元件相互拮抗。
【圖文】：

以及調(diào)控方面起著關(guān)鍵作用（Niu et al., 2018）。1.1.1 真核啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)真核生物存在 PolⅠ、PolⅡ、PolⅢ 三種 RNA 聚合酶，相應(yīng)的也有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型三種啟動(dòng)子分別與其結(jié)合并活化，從而起始基因的轉(zhuǎn)錄。Ⅰ型啟動(dòng)子主要驅(qū)動(dòng) rRNA 的轉(zhuǎn)錄，，Ⅱ型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) mRNA 和部分核小 RNA 的轉(zhuǎn)錄，Ⅲ型啟動(dòng)子負(fù)責(zé) tRNA 的轉(zhuǎn)錄。Ⅱ型啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，本研究中的啟動(dòng)子屬于Ⅱ型啟動(dòng)子。Ⅱ型啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)包括轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)（initiator, Inr）、TATAbox、CAAT box和上游順式調(diào)控元件（upstream control element, UCE）如圖 1.1。TATAbox 是 PolⅡRNA 聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合的核心元件，介導(dǎo)前轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成，控制 PolⅡRNA 聚合酶結(jié)合的位置以及轉(zhuǎn)錄起始的準(zhǔn)確性，還能控制某些啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄方向（李明和陸長(zhǎng)德，1995）。上游順式調(diào)控元件可以和反式作用因子結(jié)合從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄效率。

缺失后與報(bào)告基因融合，轉(zhuǎn)化到受體植株中通過檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)來分析不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段。單側(cè)缺失包括 5’端缺失分析和 3’端缺失分析，是從啟動(dòng)子的一側(cè)利用 PCR 手段得到一系列截短的片段。內(nèi)部缺失則是缺失掉啟動(dòng)子內(nèi)部某一區(qū)域。這種片段缺失分析方法將啟動(dòng)子劃分成幾個(gè)區(qū)域，再通過比較幾個(gè)啟動(dòng)子片段驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的情況，從而鑒定啟動(dòng)子的順式作用元件所在的區(qū)域。利用 5’端缺失分析方法，水稻 OsOPR1 啟動(dòng)子上一個(gè) 19bp 區(qū)域的茉莉酸響應(yīng)元件被發(fā)現(xiàn)（如圖 1.2）（Sobajima et al., 2007）。對(duì)煙草 NtMTPC4 啟動(dòng)子進(jìn)行缺失分析，構(gòu)建三個(gè)缺失載體和一個(gè)全長(zhǎng)載體，利用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均能驅(qū)動(dòng)外源基因在花粉中表達(dá)（劉繼愷等，2017）。對(duì)蘋果品種‘嘎拉’中β—半乳糖苷酶基因 Md-gal 啟動(dòng)子區(qū)域通過缺失分析，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子存在正調(diào)控區(qū)和負(fù)調(diào)控區(qū)，并且能響應(yīng)激素誘導(dǎo)，推測(cè)啟動(dòng)子可能和蘋果的生長(zhǎng)發(fā)育以及成熟軟化有關(guān)（蔣小兵等，2017）。柳枝稷 PvPfn2 啟動(dòng)子截短部分 413bp 被證實(shí)足以高效驅(qū)動(dòng)外源基因在維管束中表達(dá)（Xu et al., 2018）。
【學(xué)位授予單位】：中南民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2687033