【摘要】：啟動子是基因工程中的一把關(guān)鍵的鑰匙,它能夠決定外源基因的轉(zhuǎn)錄方式,選擇合適的啟動子調(diào)控不同外源基因的表達(dá)在生物學(xué)研究中具有重要作用。組織特異性啟動子能驅(qū)動外源基因在特定的部位高效表達(dá),同時還能避免組成型啟動子帶來的營養(yǎng)浪費等缺陷。發(fā)掘合適高效的組織特異型啟動子及其順式作用元件的解析是啟動子研究工作中的重點。前期本實驗室從W38型煙草中克隆得到了sm-Nvas啟動子區(qū)域的序列,生物信息學(xué)分析及轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炞C實該啟動子與維管束發(fā)育相關(guān)。本研究旨在分析sm-Nvas啟動子的驅(qū)動活性,鑒定sm-Nvas啟動子的順式作用元件,發(fā)掘新的組織特異型高效啟動子。本研究取得的結(jié)果主要有:(1)對sm-Nvas啟動子進(jìn)行5’端缺失分析,以起始密碼ATG中的A為+1位點,將sm-Nvas啟動子-799區(qū)域分為20個長度不同的5’端缺失片段,并替換p CAMBIA1301、p CAMBIA1302的35S啟動子與報告基因融合,共構(gòu)建20個5’端缺失片段-GUS重組載體和20個5’端缺失片段-GFP重組載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將這40個重組載體遺傳轉(zhuǎn)化至W38型煙草中,得到陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株。(2)完成GUS組織化學(xué)染色及GFP熒光觀察,結(jié)果進(jìn)一步證實sm-Nvas啟動子屬于組織特異型啟動子。所有得到的轉(zhuǎn)基因植株均能檢測到報告基因的表達(dá),sm-Nvas啟動子-216區(qū)域足以驅(qū)動外源基因在維管束組織中表達(dá),-216區(qū)域內(nèi)存在啟動子核心元件和維管束組織特異表達(dá)元件。(3)報告基因表達(dá)量結(jié)果顯示sm-Nvas啟動子驅(qū)動活性遠(yuǎn)高于35S啟動子,是一個維管束組織特異型強啟動子。-402～-640區(qū)域表達(dá)量顯著增高,且-640區(qū)域驅(qū)動活性最高,表明-402～-337區(qū)域存在一個能上調(diào)啟動子活性的元件。-680～-640區(qū)域存在一個能下調(diào)啟動子活性的元件,與上調(diào)啟動子活性的元件相互拮抗。
【圖文】：

以及調(diào)控方面起著關(guān)鍵作用（Niu et al., 2018）。1.1.1 真核啟動子結(jié)構(gòu)真核生物存在 PolⅠ、PolⅡ、PolⅢ 三種 RNA 聚合酶，相應(yīng)的也有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型三種啟動子分別與其結(jié)合并活化，從而起始基因的轉(zhuǎn)錄。Ⅰ型啟動子主要驅(qū)動 rRNA 的轉(zhuǎn)錄，，Ⅱ型啟動子驅(qū)動 mRNA 和部分核小 RNA 的轉(zhuǎn)錄，Ⅲ型啟動子負(fù)責(zé) tRNA 的轉(zhuǎn)錄。Ⅱ型啟動子結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，本研究中的啟動子屬于Ⅱ型啟動子。Ⅱ型啟動子結(jié)構(gòu)包括轉(zhuǎn)錄起點（initiator, Inr）、TATAbox、CAAT box和上游順式調(diào)控元件（upstream control element, UCE）如圖 1.1。TATAbox 是 PolⅡRNA 聚合酶與啟動子結(jié)合的核心元件，介導(dǎo)前轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成，控制 PolⅡRNA 聚合酶結(jié)合的位置以及轉(zhuǎn)錄起始的準(zhǔn)確性，還能控制某些啟動子的轉(zhuǎn)錄方向（李明和陸長德，1995）。上游順式調(diào)控元件可以和反式作用因子結(jié)合從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄效率。

缺失后與報告基因融合，轉(zhuǎn)化到受體植株中通過檢測報告基因的表達(dá)來分析不同長度的啟動子片段。單側(cè)缺失包括 5’端缺失分析和 3’端缺失分析，是從啟動子的一側(cè)利用 PCR 手段得到一系列截短的片段。內(nèi)部缺失則是缺失掉啟動子內(nèi)部某一區(qū)域。這種片段缺失分析方法將啟動子劃分成幾個區(qū)域，再通過比較幾個啟動子片段驅(qū)動報告基因的情況，從而鑒定啟動子的順式作用元件所在的區(qū)域。利用 5’端缺失分析方法，水稻 OsOPR1 啟動子上一個 19bp 區(qū)域的茉莉酸響應(yīng)元件被發(fā)現(xiàn)（如圖 1.2）（Sobajima et al., 2007）。對煙草 NtMTPC4 啟動子進(jìn)行缺失分析，構(gòu)建三個缺失載體和一個全長載體，利用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均能驅(qū)動外源基因在花粉中表達(dá)（劉繼愷等，2017）。對蘋果品種‘嘎拉’中β—半乳糖苷酶基因 Md-gal 啟動子區(qū)域通過缺失分析，發(fā)現(xiàn)該啟動子存在正調(diào)控區(qū)和負(fù)調(diào)控區(qū)，并且能響應(yīng)激素誘導(dǎo)，推測啟動子可能和蘋果的生長發(fā)育以及成熟軟化有關(guān)（蔣小兵等，2017）。柳枝稷 PvPfn2 啟動子截短部分 413bp 被證實足以高效驅(qū)動外源基因在維管束中表達(dá)（Xu et al., 2018）。
【學(xué)位授予單位】：中南民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2687033