【摘要】：隨著能源匱乏和環(huán)境危機的加劇,生物丁醇作為新型清潔能源和化學(xué)品備受矚目。合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展促使非天然產(chǎn)丁醇的大腸桿菌(Escherichia coli)成為丁醇生物合成的重要底盤菌株,但丁醇對細(xì)胞毒性是生物丁醇產(chǎn)量提高的瓶頸。因此,研究丁醇耐受相關(guān)的功能基因及選育耐受高濃度丁醇的菌株對高效生物丁醇生產(chǎn)十分必要。本實驗室前期利用易錯PCR全基因組改組技術(shù)篩選到兩株丁醇耐受性能良好的E.coli突變株BW1847和BW1857,本研究對兩突變株在高濃度丁醇脅迫下的生長評價發(fā)現(xiàn)其可耐受2%(v/v)的丁醇。對BW1857菌株進行突變基因鑒定,發(fā)現(xiàn)其有7個突變基因和含有17個基因的14 kb基因片段缺失。對突變及缺失基因的功能互補實驗結(jié)果表明dgsA和mdtJ基因雙缺失導(dǎo)致菌株生長和丁醇耐受力下降;tqsA基因的缺失導(dǎo)致菌株在0-0.75%(v/v)丁醇脅迫時生長受抑制,但在1-1.5%(v/v)丁醇脅迫時促進菌株的生長;rplB基因491T突變?yōu)?91A能提高BW1857突變株的丁醇耐受性。這些丁醇耐受功能基因的鑒定為丁醇耐受機制的解析及丁醇耐受菌株構(gòu)建提供了理論基礎(chǔ)。為了研究不同功能的丁醇耐受基因組合表達對菌株丁醇耐受性的影響,本研究進一步將BW1847和BW1857突變株鑒定出的丁醇耐受功能基因及已報道的丁醇耐受相關(guān)基因在大腸桿菌基因組上進行相應(yīng)過表達和缺失的組合構(gòu)建。利用染色體位點特異性無痕重組或CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)構(gòu)建出的包含有acrB缺失、rob點突變(686-687 AT缺失)的HBT1比單獨缺失或點突變菌株在0.75%(v/v)丁醇脅迫時的耐受性提高22%-26%;HBT4菌株為出發(fā)菌敲除tqsA基因獲得的HBT6菌,其丁醇耐受性比出發(fā)菌提高10%。組合構(gòu)建的acrB、tqsA缺失,rob點突變和groESL過表達的HBT6菌株在0.75%(v/v)丁醇條件下的耐受性與BW1847和BW1857相似,在1.25%(v/v)丁醇脅迫時的最大細(xì)胞密度比野生型BW25113、BW1847和BW1857的高約80%、43%和15%。說明運用組合策略可富集E.coli耐受丁醇的有益性狀。綜上所述,本研究鑒定了BW1857突變株中的丁醇耐受功能基因,為解析丁醇耐受機制奠定理論基礎(chǔ)。進一步運用組合策略研究丁醇耐受功能基因協(xié)同表達對丁醇耐受性的影響,為運用反向代謝工程構(gòu)建高效抗逆菌株提供理論依據(jù),也為合成生物學(xué)構(gòu)建丁醇生產(chǎn)菌株提供了優(yōu)良性狀的底盤菌。
【圖文】：

天津大學(xué)碩士學(xué)位論文果，因此需對丁醇合成途徑進行優(yōu)化以獲得高丁醇產(chǎn)量。1.4.2 丁醇合成途徑酶的優(yōu)化異源表達的梭菌丁醇代謝途徑中，大多數(shù)酶促反應(yīng)是可逆的，催化效果未能達到最優(yōu)水平，在引入 E. coli 后需對酶促反應(yīng)的催化劑進行優(yōu)化，其中乙酰-CoA 在硫解酶的作用下生成乙酰乙酰-CoA。Atsumi 等在表達梭菌硫解酶（thl 編碼）的同時，過表達了 E. coli 同樣能催化該反應(yīng)的乙酰轉(zhuǎn)移酶（atoB 編碼），，丁醇產(chǎn)量為對照菌株的 3 倍，這可能是由于 atoB 天然酶的活性更高[50]。天然代謝途徑利用 NADH 和還原鐵氧還蛋白（Bcd-EtfABcomplex）作為還原力的來源，若能改造丁醇途徑使 NADH 作為唯一的還原力來源，則可通過敲除混合酸

第 1 章 文獻綜述DNA 結(jié)合后，包含 HNH 和 RuvC 兩個內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域的 Cas9 蛋白會在 PAM位點上游三個堿基處切割雙鏈 DNA 分子[64]。Jinek 等人設(shè)計出一個模擬tracrRNA-crRNA 復(fù)合物的小的向?qū)?RNA（sgRNA; single-guide RNA），可通過改變與目標(biāo) DNA 序列結(jié)合的導(dǎo)向嵌合 RNA 序列使 sgRNA 靶向作用于任何感興趣的雙鏈 DNA 序列（圖 1-2）[65]，通過非同源重組連接或同源重組修復(fù)該缺口。在同源重組過程中，供體 DNA 的加入可在突變位點加入新的序列信息[63]。
【學(xué)位授予單位】：天津大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q78

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1 賀雪婷;耐丁醇大腸桿菌BW1857功能基因鑒定及耐丁醇工程菌株構(gòu)建[D];天津大學(xué);2018年

本文編號：2686888