【摘要】：光合效率是影響水稻產(chǎn)量的重要因素。在本實驗室前期研究中,發(fā)現(xiàn)一個水稻深綠穗突變體dgp1(dark green panicle1),其穗色和葉色深綠,光合效率顯著增高。通過圖位克隆技術分離DGP1基因,但是其編碼蛋白功能未知。在此基礎上,本研究通過RNA-Seq及生物信息學分析,篩選出受DGP1基因調(diào)控的下游基因,并利用RT-qPCR和蛋白免疫印跡(Western blot)方法分別檢測光合相關基因表達量和蛋白的積累量。然后通過葉綠體自發(fā)熒光及電鏡切片分析葉綠體發(fā)育狀況,并對DGP1啟動子序列進行轉錄活性分析。最終闡述DGP1基因介導葉綠體發(fā)育與葉綠素合成的分子機理。首先,通過RNA-Seq分析技術和生物信息統(tǒng)計學分析,篩選dgp1突變體相比野生型表達上或下調(diào)的基因與過表達相比野生型表達上或下調(diào)的基因。兩者比較得到190個候選差異表達基因。其中有125個基因的表達量在dgp1中最高、野生型次之、過表達中最低。有65個基因在dgp1中表達量最低、野生型較高,過表達中最高。為了進一步確認候選差異表達基因的功能及參與的生物代謝途徑,進行GO分析,發(fā)現(xiàn)候選差異基因主要集中在光合、光反應中心、葉綠體、類囊體等光合相關的場所;并進行KEGG分析,發(fā)現(xiàn)光合作用有關基因的富集率最高。然后,利用RT-qPCR對篩選出的光合相關基因表達情況進行驗證分析,結果28個光合相關基因表達量與RNA-Seq分析結果相同。再利用蛋白免疫印跡檢測光合相關蛋白的積累量,發(fā)現(xiàn)光合蛋白Lhca1、Lhca3、Lhca4、Lhcb2等在dgp1突變體中蛋白積累量最高,野生型積累量較高,過表達積累量最低。為了研究DGP1基因對葉綠體發(fā)育的影響,利用激光共聚焦顯微鏡成像檢測技術觀察水稻原生質體形態(tài),發(fā)現(xiàn)dgp1突變體中葉綠體數(shù)量較多、形態(tài)較大,野生型相對較少,過表達中葉綠體數(shù)量只有稀少的幾個且形態(tài)較小。同時葉綠體電鏡切片分析發(fā)現(xiàn),dgp1突變體內(nèi)囊體堆集較厚,野生型內(nèi)囊體堆集較稀疏,過表達內(nèi)囊體堆集較薄。在胚芽鞘中,dgp1突變體相比野生型、過表達,較早形成葉綠體。最后,對DGP1啟動子片段進行轉錄活性分析,先對啟動子片段進行分段分析。再分別構建分段的DGP1與GFP熒光蛋白融合表達載體,在煙草葉表皮細胞觀察綠色熒光,發(fā)現(xiàn)DGP1啟動子-195至-1352bp具有轉錄活性。對后續(xù)篩選DGP1基因的轉錄因子奠定基礎。綜上所述,DGP1基因突變或過表達,導致下游光合相關基因的表達量及蛋白積累量發(fā)生顯著變化,同時葉綠體發(fā)育也受到影響。這些結果對研究DGP1基因的分子機理及植物的高光效育種奠定了基礎。
【圖文】：

第一章文獻綜述逡逑光合系統(tǒng)Ｉ以三聚體和單體形式存在于體內(nèi)。它的結構己被確定是最復雜的逡逑膜蛋白。ＰＳ邋Ｉ蛋白結構如圖１．１所示Ｉ＇最顯著的特征是輔助因子約占光合系統(tǒng)逡逑Ｉ總分子量的３０％以上。輔助因子不僅對蛋白質發(fā)揮作用起到?jīng)Q定性的作用，逡逑而且在ＰＳ邋Ｉ的組裝和結構完整性中起著重要作用。光合系統(tǒng)Ｉ的一個單體單元逡逑由１２７種輔因子和多種不同蛋白質（ＰｓａＡ，邋ＰｓａＢ，ＰｓａＣ，ＰｓａＤ，邋ＰｓａＥ，邋ＰｓａＦ，逡逑ＰｓａＧ，等１６個蛋白質）共價結合組成，研究表明，，大多數(shù)輔因子和蛋白質的結逡逑合位點是特異性的且保守性較強［２８］。逡逑ＰＨＯＴＯＳＹＮＴＨＥＳＩＳ邐，邋Ｈ邋ｐｈｏｔｏｓｙｘｔｌｈｅｔｕ；邋ｏｉｒｇａｎｉｓｎａ邐邐Ｑ３Ｈ＋邋ｉ邋ＡＴＰ逡逑ＮＡＤＰＨＯ邋Ｈ＋ＪＯＱＮＡＤＰ＋邐ｈ，Ｔ邋ｌ邋（７邐＼逡逑ｈ＇邐ＣＡｎｔ邋ｈｅｎｎａ邋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ＇）邐Ｔ邐Ｉ邐／邐Ｔ邋１邋（邋＾邋）邋／逡逑／邋Ｊ邋＼邐ｃｏｎｑＤｌｅｘ邋ｄ逡逑０邋Ｏ邋Ｏ邐Ｏ邐Ｏ逡逑ＨＪ0邋Ｔ邋—邐２ｊ２Ｈ＋邐逡逑圖１．１光合系統(tǒng)示意圖逡逑Ｆｉｇｌ．ｌ邋Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ邋ｓｙｓｔｅｍ邋ｄｉａｇｒａｍ逡逑大亞基ＰｓａＡ和ＰｓａＢ是最重要的亞基，位于ＰＳ邋Ｉ單體的中心。它們含有大逡逑部分天線系統(tǒng)的葉綠素和類胡蘿卜素以及從Ｐ７００到第一個ＦｅＳ簇ＦＸ的電子傳逡逑遞鏈的大部分輔助因子［２９］。小疏水亞基位于ＰｓａＡ和ＰｓａＢ的外圍。ＰｓａＬ，邋Ｐｓａｌ逡逑和ＰｓａＭ位于單體之間的界面處

２．２邋ＰＳ邋ＩＩ復合物逡逑ＰＳＩＩ是一個獨立的復合體，在葉綠體中含量較多的膜蛋白，能夠吸收光能逡逑分解水。ＰＳＩＩ蛋白結構如圖１．１所示；它是由ＬＨＣ復合體和光合系統(tǒng)ＩＩ蛋白二聚逡逑體組成。研究證明，ＰＳＩＩ包含至少２５個多肽（圖１．２），可分為天線和核心兩逡逑部分［３７］，其中包括穩(wěn)定結合的蛋白和瞬時結合的蛋白。天線系統(tǒng)由Ｌｈｃａ和Ｌｈｃｂ逡逑兩種捕捉色素蛋白復合物組成；：Ｌｈｃｂ與５０個葉綠素ａ分子結合并與反應中心緊密逡逑結合成內(nèi)周天線（Ｉｎｎｅｒ邋ａｎｔｅｎｎａｓ）系統(tǒng)ＣＰ４３邋和ＣＰ４７（ＣＰ：邋Ｃｈｉ－Ｐｒｏｔｅｉｎ邋Ｃｏｍｐｌｅｘ），逡逑它們共同組成了邋ｐｓ邋ｎ核心復合物。與ｐｓ邋ｉｉ核心具有相互作用的是第二種天線色逡逑素－捕光色素復合物Ｌｈｃａ，它由２０－３０ＫＤａ的多肽組成，并與葉綠素ａ、葉綠素ｂ、逡逑葉黃素和胡蘿卜素結合［３８－３９］。逡逑ＰＳＩＩ復合物，由又稱外周天線，內(nèi)周天線ＣＰ４３、ＣＰ４７和反應中心ＲＣ復合逡逑物組成，ＣＰ４３、ＣＰ４７分局ＲＣ兩側。光系統(tǒng)ＩＩ的內(nèi)部觸角ＣＰ４７和ＣＰ４３，分別逡逑由葉綠體基因ＰｓｂＢ和ＰｓｂＣ編碼的產(chǎn)物構成。每個內(nèi)周天線系統(tǒng)都具有六個跨逡逑膜螺旋，它們的氨基酸序列與光系統(tǒng)Ｉ的較大反應中心的載脂蛋白片段具有較高逡逑的同源性［４０ＬＣＰ４７參與錳與蛋白的結合。ＣＰ２９是葉綠素結合蛋白和核基因ＭｃＷ逡逑６逡逑
【學位授予單位】：浙江師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S511

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本文編號：2685756