【摘要】：據(jù)最新的全球癌癥統(tǒng)計顯示,肺癌位居世界癌癥發(fā)病率與致死率的第一位。近幾十年來,雖然關(guān)于肺癌的研究已經(jīng)很多,并且設(shè)計產(chǎn)生了很多新型的靶向藥物。但由于肺癌的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,病人的五年存活率仍然低于15%。因此,對肺癌的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究將有助于發(fā)現(xiàn)新的有效治療措施。微小RNA(microRNA,miRNAs)是長度為18-25bp左右的核苷酸,最近的研究表明miRNAs在人類多種癌癥的發(fā)展進(jìn)程中起到了重要作用,關(guān)于其在腫瘤中的作用機(jī)制研究是癌癥研究領(lǐng)域的一個熱點(diǎn)。目前,有關(guān)miR-24-3p在肺癌中的功能還存在爭論,有報道顯示miR-24-3p在肺癌中可以起到促癌miRNA作用,也有報道顯示miR-24-3p在肺癌中發(fā)揮抑癌miRNA的作用,因此開展進(jìn)一步研究有望為miR-24-3p在肺癌中的具體功能提供新的證據(jù)。miR-21-5p在肺癌中高表達(dá)可以作為肺癌診斷的生物標(biāo)志物之一,且其對抑制肺癌細(xì)胞的放化療敏感性也起到了重要作用,而miR-21-5p在肺癌中具體的作用機(jī)制研究還很少,開展進(jìn)一步研究非常必要。本研究以肺癌為研究對象,分別探討肺癌中miR-24-3p和miR-21-5p是如何通過調(diào)控各自的靶基因(SOX7和TGFBI)進(jìn)而影響肺癌進(jìn)程。本研究內(nèi)容分二個部分。第一部分是研究miR-24-3p在肺癌中的功能及其作用機(jī)制。本研究首先檢測了A549、H1299及一種正常肺上皮細(xì)胞(HLF)中miR-24-3p的表達(dá)水平,結(jié)果表明A549中miR-24-3p的表達(dá)量明顯高于正常肺上皮細(xì)胞(P0.001),因此本研究使用A549做為細(xì)胞功能實驗的細(xì)胞株。采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)或抑制miR-24-3p在A549細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平,通過細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖實驗在細(xì)胞水平研究miR-24-3p對肺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。結(jié)果表明:與空白對照組相比,miR-24-3p過表達(dá)后,A549的相對細(xì)胞數(shù)上升了近20%(P0.05);其遷移細(xì)胞數(shù)上升了近260%(P0.001)。而抑制了 miR-24-3p的表達(dá)后,A549的相對細(xì)胞數(shù)降低了近22%(P0.01);其遷移細(xì)胞數(shù)降低了近50%(P0.01)。其次通過生物信息學(xué)軟件(targetscan、miRanda、PicTc),預(yù)測出了 SOX7基因可能是miR-24-3p的靶基因;為了驗證二者之間的調(diào)控關(guān)系,進(jìn)行了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?結(jié)果表明:miR-24-3p可以結(jié)合在SOX7基因mRNA的3'-UTR區(qū)域;通過TCGA數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn),肺癌中SOX7蛋白表達(dá)量相對于正常組織都發(fā)生了顯著的下調(diào)。為了進(jìn)一步探討SOX7蛋白表達(dá)量下降可能的調(diào)控機(jī)制,同時將miR-24-3p的過表達(dá)及干擾模擬物轉(zhuǎn)染進(jìn)入了二種肺癌細(xì)胞系(A549、H1299),通過westerblot實驗檢測SOX7蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果表明:與空白對照組相比,miR-24-3p過表達(dá)后,二種肺癌細(xì)胞系中SOX7蛋白的表達(dá)量下降了近30%(P0.05);而抑制了 miR-24-3p的表達(dá)后,二種肺癌細(xì)胞系中SOX7蛋白的表達(dá)量上升了近25%(P0.05)。采用qRT-PCR實驗檢測了SOX7 基因mRNA的表達(dá)情況,結(jié)果表明,過表達(dá)及干擾miR-24-3p后,SOX7基因的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生任何變化,此提示miR-24-3p在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控了 SOX7基因的表達(dá),這一結(jié)果也符合miRNA調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制。為了研究miR-24-3p調(diào)控SOX7基因的表達(dá)對肺癌細(xì)胞功能的影響,本研究在A549細(xì)胞中干預(yù)了 SOX7基因的表達(dá),過表達(dá)SOX7基因后與空白對照組相比,A549的相對細(xì)胞數(shù)降低了近40%(P0.001);其遷移細(xì)胞數(shù)下降了近60%(P0.01);與空白對照組相比,抑制了 SOX7蛋白表達(dá)后,A549的相對細(xì)胞數(shù)上升了近36%(P0.01);其遷移細(xì)胞數(shù)上升了近300%(P0.01)。以上結(jié)果表明:miR-24-3p與SOX7基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞增殖及遷移的存在相反的調(diào)控關(guān)系。為了進(jìn)一步闡明miR-24-3p通過調(diào)控SOX7基因的表達(dá)影響了肺癌細(xì)胞的增殖及遷移,還進(jìn)行了挽救實驗。結(jié)果表明:當(dāng)SOX7蛋白過表達(dá)時,可以減小miR-24-3p對肺癌細(xì)胞增殖及遷移的影響,進(jìn)一步表明miR-24-3p是通過抑制SOX7基因的表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖及遷移。最后,采用慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建miR-24-3p過表達(dá)細(xì)胞系,通過移植瘤模型驗證miR-24-3p對于肺癌腫瘤生成的影響。體內(nèi)移植瘤模型結(jié)果顯示:過表達(dá)miR-24-3p后腫瘤的生長受到促進(jìn);而過表達(dá)SOX7蛋白后,腫瘤的生長明顯被抑制。而同時過表達(dá)SOX7蛋白與miR-24-3p后,腫瘤的生長明顯慢于單獨(dú)過表達(dá)miR-24-3p組,且SOX7蛋白的表達(dá)量介于對照組與單獨(dú)過表達(dá)miR-24-3p組之間,提示SOX7減小miR-24-3p對腫瘤生長的促進(jìn)作用。第二部分研究了 miR-21-5p對TGFBI基因的調(diào)控。首先,本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn),肺癌中miR-21-5p表達(dá)量相對于正常組織發(fā)生了顯著的上升(P0.001)。為了更好的探討miR-21-5p表達(dá)量改變可能對肺癌細(xì)胞功能的影響,本研究進(jìn)行了細(xì)胞增殖實驗。結(jié)果表明:與空白對照組相比,miR-21-5p過表達(dá)后,肺癌細(xì)胞的相對細(xì)胞數(shù)上升了近20%(P0.01),而抑制了 miR-21-5p的表達(dá)后,A549的相對細(xì)胞數(shù)降低了近30%(P0.05)。以上結(jié)果表明:miR-21-5p促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的增殖。本研究通過生物信息學(xué)軟件(targetscan、miRanda、PicTc),預(yù)測出了 miR-21-5p可能調(diào)節(jié)TGFBI基因的表達(dá)。為了驗證二者之間的調(diào)控關(guān)系,首先進(jìn)行了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?結(jié)果表明:miR-21-5p可以結(jié)合在TGFBI基因mRNA的3'-UTR區(qū)域;同時在二種肺癌細(xì)胞系(A549、H1299)干預(yù)miR-21-5p的表達(dá),通過western blot實驗檢測TGFBI蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果表明:與空白對照組相比,miR-21-5p過表達(dá)后,A549細(xì)胞中TGFBI蛋白的表達(dá)量下降了近30%(P0.05),H1299細(xì)胞中TGFBI蛋白的表達(dá)量下降了近50%(P0.05);而抑制了 miR-21-5p的表達(dá)后,A549細(xì)胞中TGFBI蛋白的表達(dá)量上升了近30%(P0.05),H1299細(xì)胞中TGFBI蛋白的表達(dá)量上升了近60%(P0.01)。上述結(jié)果表明:miR-21-5p在肺癌細(xì)胞中可以調(diào)控TGFB1基因的表達(dá)。為了研究miR-21-5p促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖是由于其調(diào)控TGFB1基因的表達(dá)而實現(xiàn)的,采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)干預(yù)TGFBI基因在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平,通過CCK-8實驗及EdU實驗在細(xì)胞水平研究TGFB對肺癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明:過表達(dá)TGFBI基因后與空白對照組相比,肺癌細(xì)胞的相對細(xì)胞數(shù)降低了近30%(P0.05),抑制了 TGFBI蛋白表達(dá)后,肺癌細(xì)胞的相對細(xì)胞數(shù)上升了近60%(P0.05)。為了進(jìn)一步闡明miR-21-5p通過調(diào)控TGFBI基因的表達(dá)影響了肺癌細(xì)胞的增殖,并進(jìn)行了挽救實驗。結(jié)果表明:當(dāng)TGFBI蛋白過表達(dá)時,可以減小miR-21-5p對肺癌細(xì)胞增殖的影響,提示miR-21-5p在體外可以通過抑制TGFBI基因的表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)miR-24-3p促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的增殖與遷移,并發(fā)現(xiàn)miR-24-3p通過作用于SOX7基因發(fā)揮其促癌miRNA的功能,該研究成果為miR-24-3p在肺癌中發(fā)揮促癌miRNA作用提供了新的證據(jù);并發(fā)現(xiàn)miR-21-5p通過作用于TGFB1基因促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的增殖,揭示了 miR-21-5p在肺癌中發(fā)揮作用的新機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)了 miR-24-3p和miR-21-5p分別調(diào)控靶基因SOX7和TGFBI對肺癌進(jìn)程的影響,但它們對肺癌進(jìn)程影響是否存在疊加效應(yīng)等尚待進(jìn)一步研究。
【圖文】：

圖１．１動植物ｍｉＲＮＡｓ生物合成過程（Ｄｕ邋ａｎｄ邋Ｚａｍｏｒｅ，２00５）逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ．ｌ邋Ｔｈｅ邋ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｍｉＲＮＡｓ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔｓ邋ａｎｄ邋ａｎｉｍａｌｓ逡逑２．３邋ｍｉＲＮＡｓ調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制逡逑

圖２．１邋ｐＥＸ－３載體示意圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋ＤＮＡ邋ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐＥＸ－３逡逑
【學(xué)位授予單位】：安徽師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2

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本文編號：2685380