發(fā)布時間：2020-05-28 04:20

【摘要】：小鼠成纖維細(xì)胞生長因子21(Fibroblast growth factor21,Fgf21)作為一種重要的調(diào)控因子,對毛囊發(fā)育及生長周期具有重要作用。本實(shí)驗室通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建Fgf21基因敲除小鼠(Fgf21~(-/-)),并通過實(shí)驗證明Fgf21基因參與毛發(fā)生長速度及毛囊直徑的調(diào)控作用。MicroRNAs(mi RNAs)是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA,以堿基互補(bǔ)配對的方式識別靶mRNA,并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同誘導(dǎo)沉默復(fù)合體降解或阻遏靶mRNA的翻譯。最新研究發(fā)現(xiàn),miRNA對毛囊發(fā)育調(diào)控有重要作用。Fgf21基因在生物化學(xué)和遺傳學(xué)上與miRNA雖然存在一定聯(lián)系,但是Fgf21、miRNA以及毛囊生長發(fā)育機(jī)制的相互作用關(guān)系尚待明確。1 Fgf21~(-/-)小鼠模型的繁育及表型分析利用不同雜合子互交、雜合子與純合子正反交以及純合子互交的方式進(jìn)行Fgf21~(-/-)小鼠模型的繁育,經(jīng)過基因鑒定最終成功獲得45只Fgf21~(-/-)小鼠。表型分析發(fā)現(xiàn),Fgf21~(-/-)小鼠的產(chǎn)仔數(shù)目顯著減少(p0.05),產(chǎn)仔雌雄比例、產(chǎn)仔初生重,整體及雌雄體重生長變化等生理指標(biāo)均無顯著差異(p0.05);通過表達(dá)譜分析,生理解剖學(xué)分析發(fā)現(xiàn),與WT小鼠相比,Fgf21~(-/-)小鼠的各組織內(nèi)臟均正常,尤其是Fgf21高表達(dá)的胰臟組織并無異常;通過石蠟切片及HE染色后進(jìn)行的毛干數(shù)目統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),Fgf21~(-/-)小鼠的毛干數(shù)目顯著少于WT小鼠(p0.05)。2 Fgf21~(-/-)小鼠表皮組織的miRNA測序以Fgf21~(-/-)小鼠和WT小鼠表皮組織為材料,miRNA測序共檢出1249個不同長度miRNAs。差異miRNA表達(dá)分析的數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),差異顯著的miRNAs共134個(p0.05),其中83個表達(dá)水平上調(diào),51個下調(diào);結(jié)合文獻(xiàn)參考,從測序結(jié)果共篩選得到10個與毛囊生長發(fā)育調(diào)控相關(guān)的miRNAs,分別為mi R-377-3p、miR-335-5p、miR-214-5p、miR-148a-3p、miR-410-3p、miR-411-5p、mi R-376b-3p、mi R-376c-3p、miR-136、mi R-221-3p,之后利用熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR,RT-qRCR)進(jìn)行驗證,與測序結(jié)果相一致。3 miRNA靶基因預(yù)測及生物信息學(xué)分析利用TargetScan、miRanda兩款軟件對顯著性差異的134個mi RNAs(p0.05)分別進(jìn)行靶基因預(yù)測后取其交集共得到105,886,298個靶基因。對顯著差異mi RNA的靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集性分析,最終GO功能注釋共得到20,557個靶基因,KEGG注釋得到7,881個靶基因。通過GO富集性分析發(fā)現(xiàn)有1023個差異顯著(p0.05)的基因功能屬性,其中主要參與Protein binding、nucleus、integral component of membrane、cytoplasm和biological-process的5個功能屬性過程;KEGG注釋發(fā)現(xiàn)202條顯著差異(p0.05)的信號通路被富集,其中164條信號通路差異極顯著(p0.01),同時發(fā)現(xiàn)與毛囊發(fā)育相關(guān)的PI3K-AKT signaling pathway、P53 signaling pathway、Notch signaling pathway、TGF-beta signaling pathway、TNF signaling pathway 5條差異極顯著(p0.01)的信號通路。最終利用Cytoscape軟件分別構(gòu)建得到以驗證成功的10個顯著差異miRNAs為核心,集中調(diào)控與預(yù)測到的與毛囊發(fā)育調(diào)控相關(guān)靶基因的GO/KEGG-miRNA-靶基因的關(guān)聯(lián)圖。以上結(jié)果中異常表達(dá)的mi RNA可能參與了Fgf21對毛囊發(fā)育的調(diào)控。同時上述結(jié)果為梳理Fgf21、差異miRNA、靶基因在毛囊生長發(fā)育中的相互作用及其關(guān)系提供實(shí)驗數(shù)據(jù)。
【圖文】：

作為一種皮膚附屬物，毛囊是在不同起源（上皮、間充質(zhì)和神經(jīng)外胚層）的細(xì)相互作用導(dǎo)致的一類組織特異性的產(chǎn)物[1]。毛囊的發(fā)育和產(chǎn)后再生的典型特點(diǎn)由于細(xì)胞活性的變化引起的，包括多個信號通路、轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳調(diào)控共同作用的囊的生長發(fā)育主要通過三個不同的階段，包括生長期，退行期和休止期[2,3]。毛囊產(chǎn)化的因素很多，包括干細(xì)胞的瞬時激活，后代細(xì)胞的增殖和分化，黑色素細(xì)胞的生成細(xì)胞凋亡等作用[4-6]（圖1，引自文獻(xiàn)Miller KJ, et al, 2015, MicroRNAs in skin tissue en而毛囊依賴性的變化主要涉及 Wnt、TGF-b/BMP、hedgehog、EDAR、FGF 和 IGF路的作用[7]。然而，在哺乳動物 DNA 總量中，蛋白質(zhì)編碼基因的組成非常小。人類轉(zhuǎn)錄過是由非編碼 RNA 作用。非編碼 RNA 的亞單位通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，，轉(zhuǎn)錄，翻譯因表達(dá)。最近研究發(fā)現(xiàn)[8]，幾個長非編碼 RNA，比如 TINCR、ANKR 等，參與表皮層的形成過程[9,10]。然而，長非編碼 RNA 在毛囊發(fā)育調(diào)控的角色發(fā)展和增長在很大未知。

miRNA 在毛囊發(fā)育、循環(huán)和毛發(fā)色素沉著控制中的作用，重點(diǎn)的問題，并為研究 miRNA 在毛囊循環(huán)和發(fā)育中的作用提供了未來1 對 miRNA 的認(rèn)識生成，miRNA 的生成多發(fā)生在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中[13]（圖 2，引自文獻(xiàn) Bae of microRNAs in skin fibrosis）。其形成過程包括：（1）在細(xì)胞核中錄聚合酶 II 作用生成初級轉(zhuǎn)錄物（pri-miRNA）；（2）在 Drosha 酶pri-miRNA 被切割后形成前體 miRNA（pre-miRNA）；（3）受體 expoA 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中；（4）Pre-miRNA 由 Dicer 處理，而受體 TRNA*復(fù)合體。（5）螺旋酶解除 miRNA/miRNA*復(fù)合體的雙鏈，兩條iRNA[14-16]。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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8 蔡婷;劉志紅;王志新;趙o

本文編號：2684699