【摘要】：目的:研究干擾素-β(interferon-β,IFN-β)基因轉染的人臍帶源性間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs)中IFN-β蛋白表達情況,并進一步探討IFNβ-hucMSCs對非小細胞肺癌細胞株A549和H226克隆形成、遷移和增殖能力的影響。方法:(1)原代huc-MSCs的分離、培養(yǎng)及擴增:利用組織貼壁法從新生兒臍帶中分離出臍帶組織間充質(zhì)干細胞,流式細胞技術進行免疫表型分析。(2)根據(jù)增強型紅色熒光蛋白(Enhanced Red Fluorescent Protein,ERFP)標記的慢病毒-IFNβ基因轉染hucMSCs后取上清液作用癌細胞的不同分為以下五組:(1)IFN-β轉染組(IFNβ-hucMSCs組)、(2)空載體轉染組(NC組)、(3)間充質(zhì)干細胞組(hucMSCs組)、(4)干擾素組(IFN-β組)、(5)空白對照組(CON組)。(3)ELISA法和Western blot法分別檢測IFNβ-hucMSCs組、NC組、hucMSCs組三組細胞上清液中IFN-β蛋白含量和細胞IFN-β蛋白表達。(4)IFNβ-hucMSCs組、NC組、hucMSCs組、IFN-β組、CON組作用A549細胞和H226細胞后,采用吉姆薩染色法檢測A549細胞和H226細胞的克隆形成率,Transwell小室檢測其遷移能力、CCK-8檢測其增殖能力。結果:(1)組織塊貼壁法從臍帶分離間充質(zhì)干細胞,生長約2周左右開始有梭形細胞從臍帶周圍爬出,約3周左右細胞逐漸融合鋪滿T-25cm~2的培養(yǎng)瓶。細胞傳代至第3代可以觀察到細胞形成集落、旋渦狀生長、形態(tài)較一致。HucMSCs表達基質(zhì)細胞相關表面標記CD73、CD90、CD105;而不表達單核細胞、淋巴細胞、造血干細胞表面標記CD14、CD19、CD34,不表達人類白細胞共同抗原CD45及MHC-II類分子HLA-DR,與間充質(zhì)干細胞的表型特征相符合。(2)IFNβ-hucMSCs組24小時、48小時、72小時三個時間點上清液中的IFN-β蛋白含量分別為(1228.162±72.940pg/ml)、(1218.693±17.583pg/ml)、(1045.363±41.176pg/ml),NC組24小時、48小時、72小時三個時間點上清液中的IFN-β蛋白含量分別為(45.599±0.792pg/ml)、(47.841±2.553pg/ml)、(47.154±1.078pg/ml),hucMSCs組24小時、48小時、72小時三個時間點上清液中的IFN-β蛋白含量分別為(46.806±2.659pg/ml)、(41.955±3.007pg/ml)、(41.435±2.171pg/ml)。與NC組和hucMSCs比較,IFNβ-hucMSCs組IFN-β蛋白含量明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),而NC組IFN-β蛋白含量與hucMSCs組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。IFNβ-hucMSCs組、NC組、hucMSCs組細胞中IFN-β蛋白表達量分別為(0.684±0.136)、(0.112±0.027)、(0.105±0.042)。與NC組和hucMSCs組比較,IFNβ-hucMSCs組的IFN-β蛋白表達量明顯增高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),而NC組IFN-β蛋白表達量與hucMSCs組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)A549細胞經(jīng)處理后,IFNβ-hucMSCs組和IFN-β組的細胞克隆形成率分別為(5.557±0.306)%、(8.200±0.436)%,均低于NC組(13.567±0.289)%、hucMSCs組(13.367±0.153)%、CON組(14.000±0.200)%,且IFNβ-hucMSCs組細胞克隆率明顯低于IFN-β組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。IFNβ-hucMSCs組和IFN-β組的細胞相對遷移率分別為0.563%、1.150%,均低于NC組1.842%、hucMSC組1.823%、CON組1.850%,且IFNβ-hucMSCs組細胞相對遷移率明顯低于IFN-β組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。IFNβ-hucMSCs組和IFN-β組72小時吸光度值低于NC組、hucMSC組、CON組,且IFNβ-hucMSCs組吸光度值亦低于IFN-β組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。(4)H226細胞經(jīng)處理后,IFNβ-hucMSCs組和IFN-β組的細胞克隆形成率分別為(1.800±0.500)%、(3.100±0.100)%,均低于NC組(10.800±0.265)%、hucMSCs組(10.367±0.208)%、CON組(11.300±0.361)%,且IFNβ-hucMSCs組細胞克隆形成率明顯低于IFN-β組(P0.01),差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。IFNβ-hucMSCs組和IFN-β組的細胞相對遷移率分別為0.307%、0.588%,均低于NC組1.115%、hucMSC組1.110%、CON組1.140%,且IFNβ-hucMSCs組細胞相對遷移率明顯低于IFN-β組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。IFNβ-hucMSCs組和IFN-β組72小時吸光度值低于NC組、hucMSC組、CON組,且IFNβ-hucMSCs組亦低于IFN-β組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。結論:IFNβ-hucMSCs能顯著抑制非小細胞肺癌細胞株A549和H226的克隆形成、遷移及增殖能力等腫瘤惡性生物學行為。
【圖文】：

圖 1.蛋白標準品標準曲線10）待測樣品蛋白濃度計算方法：同樣條件下測得樣品的吸光度值，然后代入標準曲線公式即可得出待測樣品濃度。2.6.3 蛋白定量及高溫變性1）根據(jù) BCA 法繪制蛋白標準曲線后，測定提取蛋白液上清液的濃度；2）準備 96 孔板設置 2 組，每組 5 個復孔,同時，用無菌 PBS 液設置對照空白組，BCA （A）： BCA(B) 按照 50:1 比例配制混合液，每孔加入 200ul 混合液+18ulPBS+2ul 蛋白液，充分混勻，勿產(chǎn)生氣泡，如果有氣泡產(chǎn)生可以利用細針慢慢挑破，加好樣后置于 60℃烘箱孵育 30min 或者室溫 20-30min（隨時間延長，顏色慢慢變深）；3）預熱酶標儀 15min，上機檢測蛋白液的的平均吸光度值，根據(jù)預先繪制的標準曲線計算蛋白液的濃度，記錄好各待測樣品的蛋白濃度；

結果1、HucMSCs 細胞體外形態(tài)學觀察臍帶組織剪碎，培養(yǎng) 2 周左右（個別情況延長至 3 周），倒置顯微鏡下可見臍帶組織周圍有梭形、長條狀細胞生長，約 3 周左右可鋪滿瓶底。細胞消化傳代后，原代 hucMSCs 細胞生長稍緩，無明顯的梭形、旋渦形態(tài)。隨著傳代次數(shù)的增加，，細胞生長明顯加快，到第 3 代時，細胞形成集落、成旋渦狀、形態(tài)較一致、體積偏大、胞質(zhì)豐富并且折光性強（圖 2）。
【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

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1 高彩鳳;劉慶榮;劉洪濤;武英;李偉;王歡;;雷利度胺聯(lián)合干擾素對多發(fā)性骨髓瘤U266細胞腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體及其受體表達的影響[J];中國慢性病預防與控制;2015年01期

2 孫濤;張明宇;程穎;葛春林;;通過IFN-γ影響腫瘤相關巨噬細胞抑制膽囊癌血管發(fā)生的實驗研究[J];山東醫(yī)藥;2011年48期

3 李柳萍;楊胥微;王妍;;干擾素(Ⅰ型α、β,Ⅱ型γ)的分子結構和生物活性的對應關系及其臨床應用[J];微生物學免疫學進展;2011年02期

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1 王莉靜;干擾素-α和索拉菲尼聯(lián)合治療肝癌及RACK1對干擾素-α信號通路調(diào)控的研究[D];復旦大學;2012年

本文編號：2684521