【摘要】：目的:研究干擾素-β(interferon-β,IFN-β)基因轉(zhuǎn)染的人臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs)中IFN-β蛋白表達(dá)情況,并進(jìn)一步探討IFNβ-hucMSCs對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549和H226克隆形成、遷移和增殖能力的影響。方法:(1)原代huc-MSCs的分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增:利用組織貼壁法從新生兒臍帶中分離出臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞,流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行免疫表型分析。(2)根據(jù)增強(qiáng)型紅色熒光蛋白(Enhanced Red Fluorescent Protein,ERFP)標(biāo)記的慢病毒-IFNβ基因轉(zhuǎn)染hucMSCs后取上清液作用癌細(xì)胞的不同分為以下五組:(1)IFN-β轉(zhuǎn)染組(IFNβ-hucMSCs組)、(2)空載體轉(zhuǎn)染組(NC組)、(3)間充質(zhì)干細(xì)胞組(hucMSCs組)、(4)干擾素組(IFN-β組)、(5)空白對(duì)照組(CON組)。(3)ELISA法和Western blot法分別檢測(cè)IFNβ-hucMSCs組、NC組、hucMSCs組三組細(xì)胞上清液中IFN-β蛋白含量和細(xì)胞IFN-β蛋白表達(dá)。(4)IFNβ-hucMSCs組、NC組、hucMSCs組、IFN-β組、CON組作用A549細(xì)胞和H226細(xì)胞后,采用吉姆薩染色法檢測(cè)A549細(xì)胞和H226細(xì)胞的克隆形成率,Transwell小室檢測(cè)其遷移能力、CCK-8檢測(cè)其增殖能力。結(jié)果:(1)組織塊貼壁法從臍帶分離間充質(zhì)干細(xì)胞,生長(zhǎng)約2周左右開(kāi)始有梭形細(xì)胞從臍帶周?chē)莱?約3周左右細(xì)胞逐漸融合鋪滿T-25cm~2的培養(yǎng)瓶。細(xì)胞傳代至第3代可以觀察到細(xì)胞形成集落、旋渦狀生長(zhǎng)、形態(tài)較一致。HucMSCs表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)記CD73、CD90、CD105;而不表達(dá)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞表面標(biāo)記CD14、CD19、CD34,不表達(dá)人類白細(xì)胞共同抗原CD45及MHC-II類分子HLA-DR,與間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特征相符合。(2)IFNβ-hucMSCs組24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上清液中的IFN-β蛋白含量分別為(1228.162±72.940pg/ml)、(1218.693±17.583pg/ml)、(1045.363±41.176pg/ml),NC組24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上清液中的IFN-β蛋白含量分別為(45.599±0.792pg/ml)、(47.841±2.553pg/ml)、(47.154±1.078pg/ml),hucMSCs組24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上清液中的IFN-β蛋白含量分別為(46.806±2.659pg/ml)、(41.955±3.007pg/ml)、(41.435±2.171pg/ml)。與NC組和hucMSCs比較,IFNβ-hucMSCs組IFN-β蛋白含量明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),而NC組IFN-β蛋白含量與hucMSCs組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。IFNβ-hucMSCs組、NC組、hucMSCs組細(xì)胞中IFN-β蛋白表達(dá)量分別為(0.684±0.136)、(0.112±0.027)、(0.105±0.042)。與NC組和hucMSCs組比較,IFNβ-hucMSCs組的IFN-β蛋白表達(dá)量明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),而NC組IFN-β蛋白表達(dá)量與hucMSCs組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)A549細(xì)胞經(jīng)處理后,IFNβ-hucMSCs組和IFN-β組的細(xì)胞克隆形成率分別為(5.557±0.306)%、(8.200±0.436)%,均低于NC組(13.567±0.289)%、hucMSCs組(13.367±0.153)%、CON組(14.000±0.200)%,且IFNβ-hucMSCs組細(xì)胞克隆率明顯低于IFN-β組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。IFNβ-hucMSCs組和IFN-β組的細(xì)胞相對(duì)遷移率分別為0.563%、1.150%,均低于NC組1.842%、hucMSC組1.823%、CON組1.850%,且IFNβ-hucMSCs組細(xì)胞相對(duì)遷移率明顯低于IFN-β組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。IFNβ-hucMSCs組和IFN-β組72小時(shí)吸光度值低于NC組、hucMSC組、CON組,且IFNβ-hucMSCs組吸光度值亦低于IFN-β組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(4)H226細(xì)胞經(jīng)處理后,IFNβ-hucMSCs組和IFN-β組的細(xì)胞克隆形成率分別為(1.800±0.500)%、(3.100±0.100)%,均低于NC組(10.800±0.265)%、hucMSCs組(10.367±0.208)%、CON組(11.300±0.361)%,且IFNβ-hucMSCs組細(xì)胞克隆形成率明顯低于IFN-β組(P0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。IFNβ-hucMSCs組和IFN-β組的細(xì)胞相對(duì)遷移率分別為0.307%、0.588%,均低于NC組1.115%、hucMSC組1.110%、CON組1.140%,且IFNβ-hucMSCs組細(xì)胞相對(duì)遷移率明顯低于IFN-β組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。IFNβ-hucMSCs組和IFN-β組72小時(shí)吸光度值低于NC組、hucMSC組、CON組,且IFNβ-hucMSCs組亦低于IFN-β組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:IFNβ-hucMSCs能顯著抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549和H226的克隆形成、遷移及增殖能力等腫瘤惡性生物學(xué)行為。
【圖文】：

圖 1.蛋白標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線10）待測(cè)樣品蛋白濃度計(jì)算方法：同樣條件下測(cè)得樣品的吸光度值，然后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式即可得出待測(cè)樣品濃度。2.6.3 蛋白定量及高溫變性1）根據(jù) BCA 法繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線后，測(cè)定提取蛋白液上清液的濃度；2）準(zhǔn)備 96 孔板設(shè)置 2 組，每組 5 個(gè)復(fù)孔,同時(shí)，用無(wú)菌 PBS 液設(shè)置對(duì)照空白組，BCA （A）： BCA(B) 按照 50:1 比例配制混合液，每孔加入 200ul 混合液+18ulPBS+2ul 蛋白液，充分混勻，勿產(chǎn)生氣泡，如果有氣泡產(chǎn)生可以利用細(xì)針慢慢挑破，加好樣后置于 60℃烘箱孵育 30min 或者室溫 20-30min（隨時(shí)間延長(zhǎng)，顏色慢慢變深）；3）預(yù)熱酶標(biāo)儀 15min，上機(jī)檢測(cè)蛋白液的的平均吸光度值，根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白液的濃度，記錄好各待測(cè)樣品的蛋白濃度；

結(jié)果1、HucMSCs 細(xì)胞體外形態(tài)學(xué)觀察臍帶組織剪碎，培養(yǎng) 2 周左右（個(gè)別情況延長(zhǎng)至 3 周），倒置顯微鏡下可見(jiàn)臍帶組織周?chē)兴笮�、長(zhǎng)條狀細(xì)胞生長(zhǎng)，約 3 周左右可鋪滿瓶底。細(xì)胞消化傳代后，原代 hucMSCs 細(xì)胞生長(zhǎng)稍緩，無(wú)明顯的梭形、旋渦形態(tài)。隨著傳代次數(shù)的增加，，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快，到第 3 代時(shí)，細(xì)胞形成集落、成旋渦狀、形態(tài)較一致、體積偏大、胞質(zhì)豐富并且折光性強(qiáng)（圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2684521