【摘要】：匍匐莖是草莓主要的繁殖器官,然而關(guān)于調(diào)控匍匐莖發(fā)生的基因還沒(méi)有鑒定出來(lái)。本研究在無(wú)匍匐莖的森林草莓(Fragaria vesca)資源‘Yellow Wonder’(YW)的突變體庫(kù)中篩選鑒定出一個(gè)匍匐莖發(fā)生突變體并命名為strawberry runner production(srp),通過(guò)調(diào)查雜交后代性狀對(duì)srp性狀進(jìn)行遺傳分析,并對(duì)srp突變體和無(wú)匍匐莖野生型‘Ruegen’(RG)及它們雜交獲得的F2代單株組成的混池,進(jìn)行全基因組重測(cè)序以檢測(cè)突變位點(diǎn),同時(shí)利用傳統(tǒng)分子標(biāo)記進(jìn)行基因定位,最后通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)候選基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。主要結(jié)果如下:1.突變體srp可以持續(xù)產(chǎn)生匍匐莖,節(jié)間伸長(zhǎng),葉片數(shù)較野生型YW減少,株高、冠徑及葉片大小均顯著增加,冠徑小幅減少。突變體與野生型RG進(jìn)行雜交,F1雜種表型與野生型基本一致,F2群體匍匐莖有無(wú)個(gè)體分離比符合1:3的預(yù)期值,說(shuō)明突變體試材中匍匐莖發(fā)生性狀是受一個(gè)隱性單基因控制的。2.全基因組重測(cè)序BSA對(duì)突變體進(jìn)行了定位,一共檢測(cè)到480106個(gè)SNP。計(jì)算突變子代有匍匐莖混池的SNP頻率,在7條染色體上共鑒定出1583個(gè)SNP。在Fvb4上出現(xiàn)了SNP頻率的峰值,說(shuō)明了這條染色體最有可能是調(diào)控srp的基因區(qū)間。對(duì)候選SNP進(jìn)行分析,在編碼赤霉素信號(hào)途徑中抑制子DELLA的Fve RGA1基因上發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP,該SNP導(dǎo)致Fve RGA1基因發(fā)生了W601*突變(密碼子TGG→TGA),從而蛋白質(zhì)翻譯提前終止,因此推測(cè)Fve RGA1是調(diào)控srp突變體性狀的候選基因。3.利用Indel標(biāo)記,采用傳統(tǒng)遺傳作圖法進(jìn)行突變位點(diǎn)的確定。在4號(hào)染色體(Fvb4)上,根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)的差異開(kāi)發(fā)了Indel標(biāo)記和設(shè)計(jì)了CAPS/d CAPS引物。06210-HinfⅠ在突變體srp與RG雜交獲得的F2群體中與匍匐莖發(fā)生性狀共分離,這個(gè)標(biāo)記是根據(jù)Fve RGA1這個(gè)基因產(chǎn)生的單堿基突變而開(kāi)發(fā)的。因此,這些數(shù)據(jù)都進(jìn)一步證明了Fve RGA1是控制srp性狀的候選基因。4.基因克隆和測(cè)序結(jié)果表明突變體srp的Fve RGA1基因第1803個(gè)堿基的位置發(fā)生了1個(gè)鳥(niǎo)嘌呤G到腺嘌呤A的轉(zhuǎn)換(1803G-A),這個(gè)結(jié)果與重測(cè)序中得到的結(jié)果完全一致。5.構(gòu)建了Fve RGA1基因的RNAi載體,分別轉(zhuǎn)化兩個(gè)不同遺傳背景的無(wú)匍匐莖的野生型森林草莓YW和RG,所有轉(zhuǎn)基因株系中Fve RGA1基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著下調(diào)且產(chǎn)生匍匐莖,與突變體表型一致,表明Fve RGA1是控制匍匐莖發(fā)生的基因。6.從野生型YW中克隆Fve RGA1基因,將其與GUS基因融合從而構(gòu)建了Fve RGA1基因過(guò)表達(dá)載體p RI101-Fve RGA1-GUS,轉(zhuǎn)化突變體srp。過(guò)量表達(dá)Fve RGA1-GUS融合基因的轉(zhuǎn)基因植株節(jié)間性狀恢復(fù)正常,但仍然抽生匍匐莖。我們推測(cè)融合GUS基因之后影響了Fve RGA1的部分功能,因此構(gòu)建了不帶GUS基因的Fve RGA1基因過(guò)表達(dá)載體p RI101-Fve RGA1,進(jìn)行了4次遺傳轉(zhuǎn)化,但是至今沒(méi)有得到抗性芽。7.亞細(xì)胞定位結(jié)果表明Fve RGA1定位在細(xì)胞核中。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果表明Fve RGA1在草莓所有的檢測(cè)器官中均有表達(dá),并且在幼葉,葉柄及莖尖中表達(dá)量較高。對(duì)Fve RGA1的啟動(dòng)子進(jìn)行了分析,找到了很多順式作用元件,包括赤霉素響應(yīng)元件。8.選取YW和srp的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,挑選出6個(gè)差異基因并進(jìn)行了表達(dá)驗(yàn)證。
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S668.4

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本文編號(hào)：2683757