【摘要】：目的:結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)的發(fā)病率目前在歐美發(fā)達國家已經(jīng)開始明顯下降,但我國結(jié)直腸癌發(fā)病率仍然呈逐年緩慢上升趨勢,而且進展期結(jié)直腸癌病人的遠期療效仍不能讓人滿意。因此探索結(jié)直腸癌的發(fā)病機制,尋找與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展以及惡性生物學行為關(guān)系緊密的分子,作為早期診斷和靶向治療的標記物,提高早診率并延長患者生存時間對于臨床醫(yī)生顯得極為迫切。細胞的失控性異常增殖是導致腫瘤發(fā)生的一個重要前提,其本質(zhì)是細胞原癌基因的激活和抑癌基因的失活。B細胞轉(zhuǎn)位基因3(B-cell translocation gene 3,BTG3)作為抗增殖基因家族成員之一,在參與細胞DNA損傷修復、維持基因組穩(wěn)定性、誘導基因組異常細胞衰老等方面發(fā)揮重要作用。BTG3在人類正常組織中廣泛高表達,但在許多人類惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)BTG3過度低表達,而且沉默BTG3基因后可使癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力增強,凋亡能力減弱。由此推測,BTG3可能是一個潛在的抑癌基因。但是BTG3在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展、惡性表型以及臨床和預后價值方面的作用尚不明確。本課題擬對BTG3在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用以及調(diào)控腫瘤惡性生物學行為的分子機制進行研究。研究方法:1、收集140例行結(jié)直腸癌手術(shù)患者的癌組織和距癌旁5cm正常結(jié)直腸組織(經(jīng)病理切片證實未發(fā)現(xiàn)癌細胞)。應用免疫組織化學(Immunohistochemistry,IHC)染色方法比較結(jié)直腸癌組織和配對癌旁正常組織中BTG3的表達差異,通過t檢驗或方差分析研究BTG3異常表達與結(jié)直腸癌病人臨床病理特征之間的關(guān)系。Kaplan-Meier法分析BTG3表達與患者總生存率(Overall survival,OS)和無病生存率(Disease-free survival,DFS)之間的關(guān)系,Cox回歸模型對影響總生存率和無病生存率的臨床病理因素行單因素及多因素分析。構(gòu)建ROC曲線評價BTG3對結(jié)直腸癌的診斷價值。2、篩選BTG3相對高表達的結(jié)直腸癌細胞系,通過慢病毒感染細胞下調(diào)BTG3基因表達并構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系,應用Real-time PCR和Western blot檢測BTG3mRNA和蛋白水平變化以評估基因敲減效率。CCK-8法檢測下調(diào)BTG3基因?qū)毎鲋衬芰Φ挠绊?碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色檢測下調(diào)BTG3基因?qū)毎芷诘挠绊?AnnexinV-PE/7-AAD雙染法檢測下調(diào)BTG3基因?qū)毎缙诘蛲龅挠绊?Transwell實驗檢測下調(diào)BTG3基因?qū)毎w移和侵襲能力的影響。3、采用Affymetrix基因芯片檢測結(jié)直腸癌細胞BTG3表達下調(diào)后人基因組表達譜的變化,用生物信息分析軟件IPA(Ingenuity Pathway Analysis)對差異性顯著的基因,進行疾病與功能分類以及經(jīng)典信號通路的富集分析。Western blot檢測部分候選下游通路差異基因蛋白表達量,以驗證IPA生物信息分析結(jié)果的可靠性并揭示BTG3在結(jié)直腸癌中發(fā)揮生物學功能的可能分子機制。結(jié)果:1、IHC結(jié)果顯示癌組織中BTG3陽性表達的平均光密度(mean optical density,MOD)平均值為0.267,顯著低于癌旁正常結(jié)直腸組織MOD平均值0.295(P0.001)。BTG3異常表達與腫瘤分化程度(P=0.037)、腫瘤侵潤深度(P=0.016)、腫瘤遠處轉(zhuǎn)移(P=0.024)和腫瘤TNM分期(P=0.007)相關(guān);與結(jié)直腸癌病人性別、年齡、腫瘤位置、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管或神經(jīng)侵犯無顯著相關(guān)性(P0.05)。BTG3相對高表達的結(jié)直腸癌患者其OS和DFS均較BTG3相對低表達患者明顯增高(OS P=0.0045;DFS P=0.0011)。BTG3表達情況是影響結(jié)直腸癌患者OS和DFS的獨立預后因素(OS P=0.016;DFS P=0.005)。BTG3對結(jié)直腸癌診斷具有一定的參考價值,ROC曲線下面積為0.638(P0.0001)。2、BTG3蛋白在HCT116和LoVo細胞株中相對高水平表達。慢病毒成功感染上述兩種細胞后能顯著下調(diào)BTG3的mRNA和蛋白表達水平(P均0.05)。CCK8法檢測下調(diào)BTG3基因?qū)毎鲋衬芰Φ挠绊?HCT116和LoVo細胞中敲減組(shRNA1和sh RNA2)比對照組(NC)細胞增殖能力明顯增強。HCT116細胞,48h細胞增殖倍數(shù)shRNA1組和sh RNA2組均比NC組增高(4.022±0.419 vs2.279±0.054 P0.0001;3.323±0.207 vs 2.279±0.054 P=0.0008),72h細胞增殖倍數(shù)shRNA1組和sh RNA2組均比NC組增高(8.993±1.043 vs 4.649±0.078P0.0001;7.667±0.246 vs 4.649±0.078 P0.0001),96h細胞增殖倍數(shù)shRNA1組和shRNA2組均比NC組增高(12.71±1.732 vs 6.736±1.601 P0.0001;12.04±0.530 vs 6.736±1.601 P0.0001);LoVo細胞,48h細胞增殖倍數(shù)shRNA1組和shRNA2組均比NC組增高,但無統(tǒng)計學差異(3.002±0.425 vs 2.588±0.505P=0.2949;2.837±0.036 vs 2.588±0.505 P=0.6167),72h細胞增殖倍數(shù)shRNA1組和shRNA2組均比NC組增高(5.984±0.220 vs 5.232±0.109 P0.0001;5.612±0.036vs 5.232±0.109 P=0.0091),96h細胞增殖倍數(shù)shRNA1組和shRNA2組均比NC組增高(9.287±0.381 vs 7.527±0.139 P0.0001;8.374±0.274 vs 7.527±0.139 P=0.0044);PI單染法檢測下調(diào)BTG3基因?qū)毎芷诘挠绊?HCT116細胞,G1期細胞shRNA1組比NC組細胞增多(75.105±2.586 vs 61.357±2.525P=0.0002),shRNA2組比NC組細胞增多但無統(tǒng)計學差異(64.777±3.867 vs61.357±2.525 P=0.431);S期細胞shRNA1組和shRNA2組比NC組變化不明顯(14.910±3.929 vs 17.383±4.381)(21.010±4.259 vs 17.383±4.381)(P均0.05);G2期細胞shRNA1組比NC組細胞減少(9.985±3.617 vs 21.257±2.020P=0.0016),shRNA2組比NC組細胞減少(14.180±0.625 vs 21.257±2.020P=0.0435);LoVo細胞,G1期細胞shRNA1組比NC組細胞減少(54.767±2.778vs 63.153±3.199 P=0.0139),shRNA2組比NC組細胞減少但無統(tǒng)計學差異(59.300±4.859 vs 63.153±3.199 P=0.3342);S期細胞shRNA1組比NC組細胞增加(32.457±2.457 vs 14.877±4.351 P0.0001),shRNA2組比NC組細胞增加(26.717±5.061 vs 14.877±4.351 P=0.0008);G 2期細胞shRNA1組比NC組細胞減少(12.777±0.601 vs 21.970±1.304 P=0.0072),shRNA2組比NC組細胞減少(13.983±0.466 vs 21.970±1.304 P=0.0192)。由此說明下調(diào)BTG3通過減少G2期阻滯促進HCT116細胞增殖;下調(diào)BTG3通過增加S期DNA合成并減少G2期阻滯促進LoVo細胞增殖。AnnexinV-PE/7-AAD雙染法檢測下調(diào)BTG3基因?qū)毎缙诘蛲龅挠绊?HCT116細胞,shRNA1組比NC組細胞凋亡率降低(8.627±4.307 vs 23.117±4.737 P=0.0065),shRNA2組比NC組細胞凋亡率降低(13.890±1.154 vs 23.117±4.737 P=0.0469);LoVo細胞,shRNA1組比NC組細胞凋亡率降低(0.713±0.268 vs 4.783±1.590 P=0.0034),shRNA2組比NC組細胞凋亡率降低(2.283±0.284 vs 4.783±1.590 P=0.0311),說明沉默BTG3基因能抑制結(jié)直腸癌細胞凋亡。Transwell實驗檢測下調(diào)BTG3基因?qū)毎w移的影響,HCT116細胞,shRNA1組比NC組遷移細胞增多(186±8 vs 55±7 P0.0001),shRNA2組比NC組遷移細胞增多(147±8 vs 55±7 P0.0001);LoVo細胞,shRNA1組比NC組遷移細胞增多(124±12 vs 74±6 P0.0001),shRNA2組比NC組遷移細胞增多(98±7 vs 74±6 P=0.0156);對侵襲能力的影響,HCT116細胞,shRNA1組比NC組侵襲細胞增多(130±5 vs 36±6 P0.0001),shRNA2組比NC組侵襲細胞增多(92±8 vs 36±6 P0.0001);LoVo細胞,shRNA1組比NC組侵襲細胞增多(106±7 vs 47±8 P0.0001),shRNA2組比NC組侵襲細胞增多(85±8 vs 47±8 P0.0001);說明下調(diào)BTG3基因增強細胞遷移和轉(zhuǎn)移的能力。3、BTG3表達下調(diào)后基因表達譜芯片篩選出差異表達基因554個,其中上調(diào)基因281個,下調(diào)基因273個。差異基因主要在涉及細胞形態(tài)、細胞學功能、細胞周期、凋亡以及腫瘤形成、腫瘤細胞的死亡、增殖等方面發(fā)揮作用。差異基因主要影響包括ERK/MAPK通路在內(nèi)的多個經(jīng)典信號通路的狀態(tài)。Western blot驗證涉及ERK/MAPK通路的9個差異基因的蛋白表達情況,上調(diào)的有PAK2、YWHAB、RPS6KA5和STAT3;下調(diào)的有RAP1A、DUSP6和STAT1;無變化的是cFOS和ATF4。蛋白改變總體趨勢與基因芯片分析結(jié)果一致。結(jié)論:1、BTG3在結(jié)直腸癌中的表達顯著低于臨癌正常組織,并且與與腫瘤分化程度、侵潤深度、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān),BTG3在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮腫瘤抑制作用;BTG3可作為一項獨立判斷結(jié)直腸患者預后的指標;BTG3對結(jié)直腸癌的診斷具有一定參考價值。2、下調(diào)BTG3基因能顯著增強結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力,同時能抑制細胞凋亡和細胞周期阻滯。下調(diào)BTG3表達在促進結(jié)直腸癌惡性表型方面發(fā)揮重要作用。3、BTG3基因參與調(diào)節(jié)ERK/MAPK通路中若干分子的表達是其在結(jié)直腸癌細胞中發(fā)揮生物學功能的可能的分子機制。
【圖文】：

圖1.2 140例結(jié)直腸癌患者的Kaplan-Meier生存分析結(jié)果A：BTG對總生存率OS的影響； B：BTG對無病生存率DFS的影響。表1.2 總生存率和無病生存率的單因素與多因素分析

分子標志物，我們利用結(jié)直腸癌組織和配對臨癌正常結(jié)直腸組織的BTG3相對表達水平構(gòu)建了ROC曲線。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROC曲線下面積(area under the cure，，AUC)為0.638(P<0.0001，圖1.3)，說明BTG3對結(jié)直腸癌患者可能具有一定的診斷能力，是一個潛在的診斷標志物。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.34

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本文編號：2682808