發(fā)布時間：2020-05-25 20:37

【摘要】：法尼烯(farnesene)是植物果實和花香的主要揮發(fā)成分中的一種倍半萜類次生代謝產(chǎn)物,在化妝品、香料等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。法尼烯的氫化物法尼烷是一種新型清潔燃料,在生物柴油開發(fā)中有巨大潛力。在甲羥戊酸途徑(MVA)中,法尼烯合酶(farnesene synthase,FPS)具有將底物法尼烯焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)轉(zhuǎn)化成為法尼烯的作用,是該途徑中的限速酶。目前在多種植物中發(fā)現(xiàn)FPS,但是無憂樹(Saraca dives Pierre)FPS基因有待研究。本文嘗試從S.dives中克隆FPS基因完整序列,并進(jìn)行異源表達(dá)及酶活性檢測,期望得到S.dives來源的法尼烯合酶基因。利用RT-PCR技術(shù)從S.dives成年葉片獲得了S.dives的cDNA,并將其克隆到TA載體中。根據(jù)其他來源的FPS基因的保守區(qū)域設(shè)計并合成保守引物,通過PCR技術(shù)獲得了S.dives FPS基因,經(jīng)過測序分析表明該基因大小為1593 bp,GC含量為38%,蛋白大小約為58.4KDa。但是與其他物種的FPS序列比較,該基因并不完整,3'與5'端各缺少部分序列以及起始密碼子和終止密碼子。與香脂樹萜烯合酶基因序列同源性為87%。與其他物種的FPS相似度較小,推測可能是由于物種差異所致。為了保證克隆到的ORF結(jié)構(gòu)能表達(dá)蛋白,在序列上添加起始密碼子ATG和終止密碼子TAG后,將該基因序列分別克隆到原核表達(dá)載體pCold TF和真核表達(dá)載體605ADH1上,并在大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4742中表達(dá),經(jīng)過SDS-PAGE檢測目的蛋白大小與預(yù)期大小一致。蛋白與底物FPP反應(yīng)后經(jīng)過GC-MS檢測,產(chǎn)物為法尼烷(farnesane),該產(chǎn)物是法尼烯的氫化物。推測原因可能有蛋白未經(jīng)過純化、由于基因序列不完整導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化等,后續(xù)研究還需要進(jìn)一步探索。
【圖文】：

α-法尼烯的結(jié)構(gòu)式Fig1.1Structureofα-farnesene

β-法尼烯的結(jié)構(gòu)式Fig1.2Structureofβ-farnesenesynthas
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2680711