【摘要】：研究背景及目的齲病是在以細(xì)菌為主的多因素作用下,牙體硬組織發(fā)生的慢性、破壞性、細(xì)菌感染性疾病。變異鏈球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)是致齲微生物中最主要的細(xì)菌之一。強(qiáng)耐酸性是S.mutans 重要的致齲毒力之一,也是其作為致齲菌的重要生物學(xué)特性。耐酸性是S.mutans適應(yīng)牙菌斑動態(tài)變化酸性環(huán)境關(guān)鍵的生存機(jī)制,但其分子機(jī)制目前尚未完全明了。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)各項(xiàng)研究技術(shù)的發(fā)展,越來越多的與S.mutans耐酸性相關(guān)的基因及其相關(guān)蛋白被發(fā)現(xiàn),為進(jìn)一步闡明耐酸反應(yīng)的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)翻譯后修飾可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)的功能或細(xì)胞的許多生理反應(yīng),比如細(xì)胞對外界環(huán)境的應(yīng)答反應(yīng)等。乙酰化修飾是動態(tài)的、可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,和磷酸化修飾一樣,在生物體內(nèi)是重要而且廣泛存在的,如參與物質(zhì)的代謝、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、DNA與蛋白質(zhì)的相互作用、致病微生物的致病過程等。乙酰化過程由乙�；D(zhuǎn)移酶和去乙酰化酶協(xié)同調(diào)控。乙�；D(zhuǎn)移酶對細(xì)菌形態(tài),生長代謝和壓力應(yīng)激反應(yīng)具有重要作用。S.mutans UAI59中SMU.2055蛋白被認(rèn)為是假想的乙�；D(zhuǎn)移酶。這類酶的作用主要是將乙酰輔酶A(AcCoA)上的乙�；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移給底物上的氨基,選擇性乙�；�4~5個(gè)氨基之一。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),乙�；D(zhuǎn)移酶的提高,除了會導(dǎo)致細(xì)胞濃度的增加,還能夠增強(qiáng)大腸桿菌抗熱和抗氧化的能力。賴氨酸的乙�；軌蛱岣叽竽c桿菌在不同環(huán)境刺激下的生存能力。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)乙�；癄顟B(tài)可以影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和通透性,影響細(xì)菌形態(tài)和生物膜的形成。前期我們已通過基因克隆,蛋白質(zhì)純化,晶體篩選,解析了 SMU.2055蛋白的三維晶體結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)被收錄于PDB(protein data bank),編號為3LD2,運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法,設(shè)計(jì)并篩選出5個(gè)與SMU.2055蛋白結(jié)構(gòu)匹配度高的小分子化合物,建立了S mu ans UA159蛋白抑制劑的虛擬篩選模型,旨在通過小分子抑制劑改變S.mutans 致齲性。然而,目前國內(nèi)外對于SMU2055基因功能的研究尚且缺乏。為了研究SMU.2055基因在S mutans中發(fā)揮的作用,本研究擬通過構(gòu)建SMU.2055基因缺陷菌株,觀察SMU.2055基因缺陷菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu),研究其耐酸性的變化以及可能影響因素,探討SMU2055基因在S.mutans 耐酸性中發(fā)揮的作用,探究SMU.2055基因功能,對尋找齲病防治的有效靶標(biāo)具有重要意義。第一章 變異鏈球菌SMU205-5基因缺陷菌株的構(gòu)建目的:構(gòu)建SMU2055基因缺陷菌株。方法:依據(jù)NCBI提供的野生型S.mutans UA159全基因組序列,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)并合成SMU2055基因上下游引物,PCR擴(kuò)增SMU2055基因的上、下游片段,以pFW5質(zhì)粒為載體,使用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind Ⅲ經(jīng)雙酶切后與pFW5質(zhì)粒進(jìn)行連接,將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞,利用選擇性LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),篩選陽性克隆,提取質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定。使用1μg/mL的感受態(tài)刺激肽將構(gòu)建成功的SMU.2055基因缺陷重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入野生型S.mutans,構(gòu)建SMU2055基因缺陷菌株。利用選擇性BHI培養(yǎng)基篩選陽性克隆,提取陽性克隆的基因組DNA進(jìn)行PCR及測序鑒定。結(jié)果:經(jīng)過PCR和測序鑒定,SMU2055基因缺陷菌株構(gòu)建成功。第二章 變異鏈球菌SMU.2055基因?qū)δ退嵝宰饔玫挠绊懩康?掃描電鏡,透射電鏡下觀察野生型S.mutans UA159、SMU2055基因缺陷菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu),研究兩種菌株在不同pH條件下的生長、致死性pH值、糖酵解能力、細(xì)胞通透性、質(zhì)子通透性、H+-ATPase活性及生物膜形成能力,探究SMU.2055基因在Smutans耐酸性中發(fā)揮的作用,進(jìn)一步研究SMU.2055基因的功能。方法:1.掃描電鏡(SEM)觀察。S.mutans UA159及SMU2055基因缺陷過夜培養(yǎng),調(diào)節(jié)菌液OD600≈0.8,1:100稀釋,37℃厭氧培養(yǎng)16h后,棄去菌液,取出蓋玻片,2%戊二醛固定1h,乙醇梯度脫水30min,干燥,噴金,掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。2.透射電鏡(TEM)觀察。S.mutans UA159及SMU2055基因缺陷菌株過夜培養(yǎng),調(diào)節(jié)菌液OD600≈0.8,按1:100加入液體培養(yǎng)基中,37℃厭氧培養(yǎng)至對數(shù)生長期,3000 r/min離心,去上清液后加入0.3%戊二醛預(yù)固定15-30 mim,10,000 r/min離心15 min,采用2%戊二醛固定,1%四氧化鋨再固定,丙酮梯度脫水,包埋,切片,醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色,透射電子顯微鏡觀察。3.探究兩種菌株在不同pH條件下的生長情況。將過夜培養(yǎng)的S.mutans UA159和SMU2055基因缺陷菌株清洗,離心,重懸,調(diào)整OD600約相等,按1:100加入新的pH 7.5或pH 5.5 BHI培養(yǎng)基中,37℃,厭氧培養(yǎng)。每1h取1mL菌液,測量各菌液的OD600值,連續(xù)監(jiān)測24 h,繪制各菌株的生長曲線。4.致死性pH值實(shí)驗(yàn)。將S mutans UA159和SMU.2055基因缺陷菌株培養(yǎng)至對數(shù)中期,轉(zhuǎn)入以0.5為間隔的pH值為2.5-7.0的BHI液體培養(yǎng)基。厭氧培養(yǎng)3h后取樣,稀釋,涂板,48 h后計(jì)數(shù)活菌數(shù)。5.探究兩菌株糖酵解能力。將S.mutans UA159和SMU.2055基因缺陷菌株培養(yǎng)至靜止早期,重懸于50mMl KC1,1mM MgCl2溶液中。KOH滴定至pH 7.2以上,加葡萄糖至終濃度為1%,每隔2 min檢測菌液pH值,連續(xù)監(jiān)測30 min。pH所能達(dá)到的最低值為糖酵解最低pH值。6.探究兩菌株細(xì)胞通透性。將S.mutans UA159和SMU2055基因缺陷菌株過夜培養(yǎng)后,取25 mL重懸在2.5 mL Tris-HC1緩沖液中(75 mM,pH 7.0,含有10 mM MgSO4)。加入250μL甲苯,37℃孵育5 min,凍融,重懸,根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒使用說明書檢測蛋白濃度。7.探究兩菌株質(zhì)子通透性。將S.mutans UA159和SMU.2055基因缺陷菌株過夜培養(yǎng),重懸于PBS緩沖液,孵育2 h。離心,重懸于50 mM KC1、1mM MgC12溶液中至濃度達(dá)到20 mg/mL。調(diào)節(jié)pH至4.7以下,每10 min測量菌液pH值,在50 min時(shí)加入終濃度為10%的丁醇,80 min時(shí)記錄最終pH。8.探究兩菌株不同pH條件下H+-ATPase活性。將制備好的通透細(xì)胞(pH值為7.5或5.5)重懸于75mMTirs-HC1緩沖液(pH7.0,含1lmMMgSO4)。取3mL菌液,以同樣的緩沖液為空白對照,測菌液OD600。依據(jù)細(xì)胞干重與吸光度的關(guān)系曲線,推算出菌液濃度。根據(jù)H+/K+-ATP酶測定試劑盒使用說明書進(jìn)行酶促反應(yīng),定磷。計(jì)算出不同pH條件下的H+-ATPase活性。9.探究兩菌株不同pH條件下生物膜形成情況。S.mutans UA159和SMU.2055基因缺陷菌株過夜培養(yǎng)后,按1:100加入BHI液體培養(yǎng)基(pH值為7.5或5.5),取5 mL,分別轉(zhuǎn)移至已放置無菌蓋玻片的六孔板中,厭氧培養(yǎng)24 h后,洗滌,干燥,使用SYT09對細(xì)菌形成的生物膜進(jìn)行染色,激光共聚焦顯微鏡觀察,隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行拍照。10.實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,P0.05代表具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果:1.SEM結(jié)果顯示,SMU.2055基因缺陷株形態(tài)及菌體間物質(zhì)出現(xiàn)明顯的改變。野生型S.mutans UA159細(xì)菌形態(tài)規(guī)則,包膜光滑完整,呈球桿狀,菌體間存在不規(guī)則物質(zhì)。而SMU.2055基因缺陷菌株菌體較野生型的長,部分細(xì)菌呈團(tuán)塊狀分布,菌體間不規(guī)則物質(zhì)較少。2.TEM觀察,野生型S.mutams UA159形態(tài)正常,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整,分裂狀態(tài)下細(xì)菌兩級對稱,分裂后細(xì)菌形態(tài)一致。SMU2055基因缺陷菌株細(xì)胞膜較模糊,完整性被破壞。3.與野生菌株相比,SMU.2055基因缺陷菌株在pH 7.5和pH 5.5的BHI培養(yǎng)基中的早期生長均受到明顯的影響。缺陷菌株的遲緩期延長,進(jìn)入平臺期所需要時(shí)間增多。pH 5.5時(shí)兩種菌株早期的OD600明顯低于pH 7.5時(shí),菌株的生長受到抑制,缺陷菌株生長受抑制情況更加明顯,20 h后兩種菌株在pH 7.5和pH 5.5時(shí)的終末菌液濃度沒有明顯差異。4.隨著pH值逐漸下降,兩種菌株生存能力逐漸減弱。野生型Smu0ans UA159的致死性pH值為3.5,SMU2055基因缺陷菌株的致死性pH值為4.0。5.在前18 mim的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上,UA159反應(yīng)體系的pH值均低于缺陷菌株,早期野生菌株糖酵解速率明顯高于缺陷菌株,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。但兩者糖酵解的最低pH值沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明SMU2055基因的缺失沒有影響細(xì)菌的糖酵解能力。6.野生型 S.mutans UA159 的蛋白濃度為 1.2768±0.2639 mg/mL,SMU2055基因缺陷菌株的蛋白濃度為1.6297±0.1249 mg/mL,與野生型相比,SMU2055基因缺陷菌株細(xì)胞通透性增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。7.SMU2 55基因缺陷菌株在50 min到80 min時(shí)曲線的斜率小于野生菌株,80mim時(shí)pH值低于野生菌株,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。說明SMU.2055基因缺陷菌株對質(zhì)子的通透性增強(qiáng)。8.pH 7.5時(shí),與野生型S.mutans UA159相比,SMU.205_5基因缺陷菌株的H+-ATPase活性略微降低,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。pH 5.5時(shí),SMU.2055基因缺陷菌株的H+-ATPase活性明顯低于野生菌株,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。9.在pH 7.5和pH 5.5時(shí),野生型SmutansUAI59形成的生物膜較為致密,細(xì)菌團(tuán)塊較大,SMU.2055基因缺陷菌株所形成的生物膜較野生型稀疏,細(xì)菌團(tuán)塊較小,呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),存在不規(guī)則圓形或橢圓形大小不一的孔隙。SMU2055基因缺陷菌株形成生物膜的能力均明顯低于野生菌株。在pH 5.5時(shí)兩種菌株形成生物膜的能力均高于pH 7.5時(shí),且形成的生物膜更加致密,細(xì)菌團(tuán)塊更大,幾乎遍布整個(gè)視野。結(jié)論:1.S.mutans中SMU2055基因與耐酸性密切相關(guān)。2.SMU.2055基因的缺陷可能影響細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),影響S.mutans在不同pH條件下的早期生長、致死性pH值、細(xì)胞通透性、質(zhì)子通透性、pH 5.5時(shí)H+-ATPase活性及生物膜形成能力,但與其糖酵解能力無關(guān)。
【圖文】：

前期我們運(yùn)用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研[偡椒�，通过基因克隆和睗玩|⒌鞍字蝕炕�、辶x暇逕稈�、晶体讶O涫菔占�，，解斡z櫻停眨玻埃擔(dān)檔鞍茲褰峁梗郟玻叮保ㄍ跡玻�，辶x希沖義

本文編號：2680486