發(fā)布時間：2020-05-25 16:47

【摘要】：綠僵菌(Metarhizium)是一類重要的昆蟲病原真菌,在生物防治中起到關(guān)鍵的作用。盡管綠僵菌作為生物農(nóng)藥有著許多化學農(nóng)藥無法比擬的優(yōu)點,如環(huán)境污染少、選擇性強、具有觸殺性等,但是其殺蟲速度慢、貨架期短、防效不穩(wěn)定等缺點嚴重制約了其大規(guī)模應(yīng)用。綠僵菌在田間施用時,其防效和環(huán)境逆境如高溫、強紫外輻射等因素密切相關(guān)。因此研究綠僵菌抗逆機制對提高其防效及穩(wěn)定性具有重要意義。Rab GTP酶通過在GTP結(jié)合的激活態(tài)和GDP結(jié)合的失活態(tài)之間轉(zhuǎn)換起著分子開關(guān)的作用,參與多種細胞活動。Rab GTP酶激活蛋白(GAP)是GTP酶活性轉(zhuǎn)換過程中的重要調(diào)控因子。目前,關(guān)于GTP酶激活蛋白的研究多集中于哺乳動物、酵母和植物病原菌中,而在昆蟲病原菌中少有。本研究以昆蟲病原真菌蝗綠僵菌(M.acridum)為實驗材料。蝗綠僵菌基因組數(shù)據(jù)分析表明蝗綠僵菌中有11個假定Rab GTP酶激活蛋白,它們均有保守的TBC結(jié)構(gòu)域。本研究選取其中一個假定的Rab GAP蛋白MaGyp2,對其基因進行功能分析。通過同源重組的方法構(gòu)建MaGyp2的敲除及回復(fù)菌株,分析其功能。獲得了以下實驗結(jié)果:1.MaGyp2生物信息學分析根據(jù)蝗綠僵菌基因組序列設(shè)計引物,克隆得到MaGyp2基因。該基因全長3,461bp,含有2個外顯子,cDNA序列全長3,369 bp,編碼1,122個氨基酸,其蛋白質(zhì)分子量為123.8 kDa,等電點為5.43。與酵母中的Gyp氨基酸序列進行比對,發(fā)現(xiàn)MaGyp2具有TBC結(jié)構(gòu)域并且含有3個保守的特征基序。2.MaGyp2敲除及回復(fù)菌株的獲得為了研究蝗綠僵菌MaGyp2的功能,利用同源重組構(gòu)建了該基因的敲除載體,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了回復(fù)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化蝗綠僵菌,經(jīng)過抗性篩選、PCR驗證篩選以及Southern雜交驗證,得到正確的MaGyp2敲除菌株和回復(fù)菌株。3.MaGyp2影響菌株對紫外的敏感性野生型菌株(WT)、敲除菌株(ΔMaGyp2)和回復(fù)菌株(CP)經(jīng)紫外照射處理,培養(yǎng)20 h后分別統(tǒng)計其孢子萌發(fā)率。結(jié)果顯示,紫外照射后與WT和CP相比,ΔMaGyp2孢子萌發(fā)率顯著降低,紫外敏感性顯著增強。4.紫外處理誘導(dǎo)MaGyp2上調(diào)表達定量PCR分析結(jié)果顯示,與對照組(紫外照射處理0 h)相比,WT菌株經(jīng)紫外處理1.5 h、3 h、4.5 h后MaGyp2的表達量顯著上升。5.MaGyp2影響菌株抗氧化的能力抗氧化能力分析實驗表明,與WT相比,H_2O_2對ΔMaGyp2的抑制效果更加顯著,ΔMaGyp2抗氧化能力顯著降低。6.MaGyp2影響紫外修復(fù)及抗氧化基因的表達利用qRT-PCR技術(shù)對紫外相關(guān)基因和抗氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),紫外相關(guān)基因Uve1、WC1、Cpb在ΔMaGyp2中表達量降低。紫外處理后,抗氧化相關(guān)基因在ΔMaGyp2中下調(diào)表達。7.MaGyp2不影響菌株的生長、濕熱抗性和毒力等ΔMaGyp2在孢子萌發(fā)速率、濕熱抗性、毒力等生長、抗性及致病性方面與WT相比無顯著差異。8.MaGyp2的缺失誘導(dǎo)Gyp家族其他成員的表達量上調(diào)利用qRT-PCR技術(shù),分別檢測Gyp家族其他成員在WT與ΔMaGyp2中的表達量。結(jié)果顯示,Gyp家族其余10個成員中有7個基因在ΔMaGyp2中顯著上調(diào)表達。
【圖文】：

重慶大學碩士學位論文 1 緒 論與菌絲頂端細胞微泡的運輸及調(diào)節(jié)，YPT-1定位于高爾基體，參與高爾基體物質(zhì)運輸，并調(diào)節(jié)多種分泌途徑[64]。Rab蛋白通過在GDP結(jié)合的失活態(tài)和GTP結(jié)合的激活態(tài)之間循環(huán)行使生物學功能。Rab蛋白失活態(tài)和激活態(tài)的轉(zhuǎn)化需要GDP解離抑制因子(GDP dissociationinhibitor，GDI)、鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)和GTPase激活蛋白(GTPase activating protein，GAP)等效應(yīng)子的參與。GDI調(diào)控Rab蛋白在膜上的連接和解離，它只與異戊二烯化修飾的無活性Rab蛋白連接，將Rab-GDP保持在胞液中。Rab蛋白和GDI的解離則需要GEF的參與。GEF催化GDP與GTP的交換，一旦Rab蛋白定植在膜上便被GEF激活。激活的Rab通過與上/下游效應(yīng)器的結(jié)合位點與多種蛋白質(zhì)相互作用，以執(zhí)行不同的細胞生理功能。當Rab蛋白在膜上完成任務(wù)，GAP催化GTP水解，，Rab蛋白失活不再與效應(yīng)器結(jié)合。Rab-GDP在GDI的協(xié)助下從膜上解離回到胞質(zhì)為下一輪循環(huán)做準備（圖1.1）[53,65-67]。

26圖 2.1 MaGyp2 生物信息學分析a. 綠僵菌Gyp家族成員TBC結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ龋娇蝻@示結(jié)構(gòu)域保守基序。b. 綠僵菌MaGyp2與釀酒酵母同源基因ScMdr1pTBC結(jié)構(gòu)域比對。c. MaGyp2的系統(tǒng)發(fā)育樹分析。每個節(jié)點的數(shù)字表示自展值；利用MEGA 6.0軟件對MaGyp2進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建分析。Fig. 2.1 Sequence analysis of MaGyp2a. Comparison of the TBC domains sequence of the Gyp family in M. acridum. Red boxe
【學位授予單位】：重慶大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S476.12

【參考文獻】

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1 谷祖敏;陳思;韓金棟;李修偉;周飛;;環(huán)境脅迫因子對殺蟲真菌蠟蚧輪枝菌VL18的影響[J];沈陽農(nóng)業(yè)大學學報;2014年01期

2 袁兵兵;張海青;陳靜;;微生物農(nóng)藥研究進展[J];山東輕工業(yè)學院學報(自然科學版);2010年01期

3 孫懷山;;微生物農(nóng)藥在我國開發(fā)應(yīng)用情況綜述[J];安徽農(nóng)學通報(上半月刊);2009年19期

4 謝玉英;;談活性氧與人類疾病[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技;2009年15期

5 馬曉梅;朱西儒;田長恩;;我國微生物農(nóng)藥研究與應(yīng)用的新進展[J];武漢科技學院學報;2006年11期

6 范瑛閣,曹遠銀;微生物源農(nóng)藥的研究進展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學;2005年07期

7 樊俊蝶,王偉,梁愛華;Rab蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及進化[J];生命的化學;2004年01期

8 張國洲;生物農(nóng)藥研究進展[J];湖北農(nóng)學院學報;2002年05期

9 姚建仁,鄭永權(quán);中國農(nóng)作物病蟲害發(fā)生演替趨勢與未來的農(nóng)藥工業(yè)[J];世界農(nóng)藥;2001年04期

10 涂玉琴;生物農(nóng)藥的研究和應(yīng)用進展[J];江西植保;1998年04期

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 張冬梅;稻瘟病菌Rab蛋白功能研究[D];福建農(nóng)林大學;2009年

本文編號：2680446