發(fā)布時(shí)間：2020-05-25 16:47

【摘要】：綠僵菌(Metarhizium)是一類重要的昆蟲病原真菌,在生物防治中起到關(guān)鍵的作用。盡管綠僵菌作為生物農(nóng)藥有著許多化學(xué)農(nóng)藥無法比擬的優(yōu)點(diǎn),如環(huán)境污染少、選擇性強(qiáng)、具有觸殺性等,但是其殺蟲速度慢、貨架期短、防效不穩(wěn)定等缺點(diǎn)嚴(yán)重制約了其大規(guī)模應(yīng)用。綠僵菌在田間施用時(shí),其防效和環(huán)境逆境如高溫、強(qiáng)紫外輻射等因素密切相關(guān)。因此研究綠僵菌抗逆機(jī)制對(duì)提高其防效及穩(wěn)定性具有重要意義。Rab GTP酶通過在GTP結(jié)合的激活態(tài)和GDP結(jié)合的失活態(tài)之間轉(zhuǎn)換起著分子開關(guān)的作用,參與多種細(xì)胞活動(dòng)。Rab GTP酶激活蛋白(GAP)是GTP酶活性轉(zhuǎn)換過程中的重要調(diào)控因子。目前,關(guān)于GTP酶激活蛋白的研究多集中于哺乳動(dòng)物、酵母和植物病原菌中,而在昆蟲病原菌中少有。本研究以昆蟲病原真菌蝗綠僵菌(M.acridum)為實(shí)驗(yàn)材料�；染G僵菌基因組數(shù)據(jù)分析表明蝗綠僵菌中有11個(gè)假定Rab GTP酶激活蛋白,它們均有保守的TBC結(jié)構(gòu)域。本研究選取其中一個(gè)假定的Rab GAP蛋白MaGyp2,對(duì)其基因進(jìn)行功能分析。通過同源重組的方法構(gòu)建MaGyp2的敲除及回復(fù)菌株,分析其功能。獲得了以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.MaGyp2生物信息學(xué)分析根據(jù)蝗綠僵菌基因組序列設(shè)計(jì)引物,克隆得到MaGyp2基因。該基因全長(zhǎng)3,461bp,含有2個(gè)外顯子,cDNA序列全長(zhǎng)3,369 bp,編碼1,122個(gè)氨基酸,其蛋白質(zhì)分子量為123.8 kDa,等電點(diǎn)為5.43。與酵母中的Gyp氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)MaGyp2具有TBC結(jié)構(gòu)域并且含有3個(gè)保守的特征基序。2.MaGyp2敲除及回復(fù)菌株的獲得為了研究蝗綠僵菌MaGyp2的功能,利用同源重組構(gòu)建了該基因的敲除載體,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了回復(fù)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化蝗綠僵菌,經(jīng)過抗性篩選、PCR驗(yàn)證篩選以及Southern雜交驗(yàn)證,得到正確的MaGyp2敲除菌株和回復(fù)菌株。3.MaGyp2影響菌株對(duì)紫外的敏感性野生型菌株(WT)、敲除菌株(ΔMaGyp2)和回復(fù)菌株(CP)經(jīng)紫外照射處理,培養(yǎng)20 h后分別統(tǒng)計(jì)其孢子萌發(fā)率。結(jié)果顯示,紫外照射后與WT和CP相比,ΔMaGyp2孢子萌發(fā)率顯著降低,紫外敏感性顯著增強(qiáng)。4.紫外處理誘導(dǎo)MaGyp2上調(diào)表達(dá)定量PCR分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組(紫外照射處理0 h)相比,WT菌株經(jīng)紫外處理1.5 h、3 h、4.5 h后MaGyp2的表達(dá)量顯著上升。5.MaGyp2影響菌株抗氧化的能力抗氧化能力分析實(shí)驗(yàn)表明,與WT相比,H_2O_2對(duì)ΔMaGyp2的抑制效果更加顯著,ΔMaGyp2抗氧化能力顯著降低。6.MaGyp2影響紫外修復(fù)及抗氧化基因的表達(dá)利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)紫外相關(guān)基因和抗氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),紫外相關(guān)基因Uve1、WC1、Cpb在ΔMaGyp2中表達(dá)量降低。紫外處理后,抗氧化相關(guān)基因在ΔMaGyp2中下調(diào)表達(dá)。7.MaGyp2不影響菌株的生長(zhǎng)、濕熱抗性和毒力等ΔMaGyp2在孢子萌發(fā)速率、濕熱抗性、毒力等生長(zhǎng)、抗性及致病性方面與WT相比無顯著差異。8.MaGyp2的缺失誘導(dǎo)Gyp家族其他成員的表達(dá)量上調(diào)利用qRT-PCR技術(shù),分別檢測(cè)Gyp家族其他成員在WT與ΔMaGyp2中的表達(dá)量。結(jié)果顯示,Gyp家族其余10個(gè)成員中有7個(gè)基因在ΔMaGyp2中顯著上調(diào)表達(dá)。
【圖文】：

重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 緒 論與菌絲頂端細(xì)胞微泡的運(yùn)輸及調(diào)節(jié)，YPT-1定位于高爾基體，參與高爾基體物質(zhì)運(yùn)輸，并調(diào)節(jié)多種分泌途徑[64]。Rab蛋白通過在GDP結(jié)合的失活態(tài)和GTP結(jié)合的激活態(tài)之間循環(huán)行使生物學(xué)功能。Rab蛋白失活態(tài)和激活態(tài)的轉(zhuǎn)化需要GDP解離抑制因子(GDP dissociationinhibitor，GDI)、鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)和GTPase激活蛋白(GTPase activating protein，GAP)等效應(yīng)子的參與。GDI調(diào)控Rab蛋白在膜上的連接和解離，它只與異戊二烯化修飾的無活性Rab蛋白連接，將Rab-GDP保持在胞液中。Rab蛋白和GDI的解離則需要GEF的參與。GEF催化GDP與GTP的交換，一旦Rab蛋白定植在膜上便被GEF激活。激活的Rab通過與上/下游效應(yīng)器的結(jié)合位點(diǎn)與多種蛋白質(zhì)相互作用，以執(zhí)行不同的細(xì)胞生理功能。當(dāng)Rab蛋白在膜上完成任務(wù)，GAP催化GTP水解，，Rab蛋白失活不再與效應(yīng)器結(jié)合。Rab-GDP在GDI的協(xié)助下從膜上解離回到胞質(zhì)為下一輪循環(huán)做準(zhǔn)備（圖1.1）[53,65-67]。

26圖 2.1 MaGyp2 生物信息學(xué)分析a. 綠僵菌Gyp家族成員TBC結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ�，方框顯示結(jié)構(gòu)域保守基序。b. 綠僵菌MaGyp2與釀酒酵母同源基因ScMdr1pTBC結(jié)構(gòu)域比對(duì)。c. MaGyp2的系統(tǒng)發(fā)育樹分析。每個(gè)節(jié)點(diǎn)的數(shù)字表示自展值；利用MEGA 6.0軟件對(duì)MaGyp2進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建分析。Fig. 2.1 Sequence analysis of MaGyp2a. Comparison of the TBC domains sequence of the Gyp family in M. acridum. Red boxe
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S476.12

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2680446