【摘要】：樺褐孔菌Inonotus obliquus(Ach.ex Pers.)Pilat屬銹革孔菌科,纖孔菌屬,主要成分有多糖、樺褐孔菌醇、樺褐孔菌素、三萜類化合物等,具有抗癌、降血糖、降血脂、抗氧化等多種藥用功能。三磷酸甘油醛脫氫酶(GPD)是維持生命活動最基本的酶之一,參與組織中的糖酵解過程,常用于真菌的逆境脅迫和菌種的分類鑒定。GPD啟動子含有TATA box、CART box和一個多CT序列,具有很強的調控異源基因轉錄的功能,目前GPD啟動子已經(jīng)作為外源基因啟動子用于轉化香菇、平菇、草菇、雙孢菇、靈芝等。本試驗以樺褐孔菌為試驗材料,克隆GPD基因及啟動子序列,并對其進行分析,為樺褐孔菌菌株的分類鑒定、功能研究及高效表達載體的建立提供基因資源。1.使用簡并引物PCR和RACE技術克隆了樺褐孔菌GPD基因(IoGPD)的全長序列,其長度為1223 bp,編碼339個氨基酸。2.氨基酸序列分析表明,IoGPD沒有信號肽序列,定位于細胞質,屬于3-磷酸甘油醛脫氫酶家族中的I型。3.對IoGPD編碼的氨基酸序列進行相似性搜索,結果顯示IoGPD與真菌的GPD同源,與同屬纖孔菌屬的鮑姆桑黃和同為銹革孔菌科的地中海嗜藍孢孔菌GPD蛋白相似性最高,達88%。4.利用染色體步移技術從樺褐孔菌JL01菌株中成功克隆獲得了 IoGPD啟動子序列446 bp。5.序列分析結果表明IoGPD啟動子在152 bp和160 bp處有兩個轉錄起始位點,含有TATA、CAAT、CCAATbox等啟動子基本元件,而且還包括調控低溫、光照、生理晝夜節(jié)律控制和參與蛋白代謝調節(jié)等重要順式作用元件LTR、02-site、circadian、Sp1、TCCC-motif等。
【圖文】：

２．１三磷酸甘油醛脫氫酶基因全長的克隆逡逑２．１．１樺褐孔菌總ＲＮＡ的提取逡逑使用Ｔｒｉｚｏｌ改良法提取樺褐孔菌總ＲＮＡ邋（如圖１所示），圖中２８Ｓ、１８Ｓ清逡逑晰可見，且２８Ｓ條帶亮度是１８Ｓ條帶亮度的兩倍，說明ＲＮＡ完整降解少，效率逡逑高，可用于進行后續(xù)試驗。逡逑：二逡逑ｙ：二：逡逑圖１樺褐孔菌總ＲＮＡ電泳檢測圖逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｉｎｏｎｏｔｕｓ邋ｏｂｌｉｑｕｕｓ逡逑２．１．２三磷酸甘油醛脫氫酶基因片段的克隆逡逑將提取的樺褐孔菌總ＲＮＡ進行反轉錄合成ｃＤＮＡ第一條鏈，以此為模板進逡逑行簡并ＰＣＲ擴增，獲得ＧＰＤ基因片段與預期大小相一致（如圖２所示）�；蝈义掀螠y序結果表明，ＧＰＤ基因片段長９４５邋ｂｐ，基因比對結果顯示，三磷酸甘油逡逑醛脫氫酶基因片段與云芝（ＸＭ＿００８０４１８９７．１邋）基因相似性為９７％，因此，初步逡逑判定該基因片段為樺褐孔菌的ＧＰＤ基因片段。逡逑Ｍ１２３邐４５６７逡逑５００邋ｂｐ—？邋■逡逑圖２樺褐孔菌ＧＰＤ基因片段的電泳檢測圖逡逑Ｆｉｇ．２邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｆｒａｇｍｅｎｔｓ邋ｏｆ邋ＧＰＤ

根據(jù)獲得的ＧＰＤ基因片段設計基因特異性引物，將提取的總ＲＮＡ按照逡逑ＲＡＣＥ試劑盒的要求進行ｃＤＮＡ第一條鏈的合成，然后進行ＰＣＲ擴增獲得ＧＰＤ逡逑基因的５１端和端（如圖３所示），將其進行回收、連接、轉化等操作后送去測逡逑序。逡逑Ｍ邋１邐２邐Ｍ邋１邐２逡逑２000ｂＰ—？邐sE二邐焌灥奏看逡逑Ｂ１邐Ｂ２逡逑圖３樺褐孔菌ＧＰＤ基因的５ＨＡＣＥ和ＴＲＡＣＥ電泳圖逡逑Ｆｉｇ．３邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋５邋＾ＲＡＣＥ邋ａｎｄ邋３邋＾ＡＣＥ邋ｏｆ邋ＧＰＤ邋ｇｅｎｅ逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００邋ｍａｒｋｅｒ；邋Ｂｌ：邋５，ＲＡＣＥ邋產(chǎn)物；Ｂ２：邋３，ＲＡＣＥ邋產(chǎn)物逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；邋Ｂ１：邋Ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋５＇ＲＡＣＥ；邋Ｂ２：邋Ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋３ｆＲＡＣＥ逡逑２．１．４三磷酸甘油醛脫氫酶基因全長的克隆逡逑將擴增得到的保守區(qū)片段與ＲＡＣＥ克隆獲得５＇端和３＇端序列進行拼接，并根逡逑據(jù)拼接結果設計用于克隆三磷酸甘油醛脫氫酶基因全長的特異性引物，以ｃＤＮＡ逡逑為模板，進行ＰＣＲ擴增（如圖４所示），將ＰＣＲ產(chǎn)物進行切膠、回收、連接轉逡逑化和菌液檢測后送去測序。三磷酸甘油醛脫氫酶基因全長測序結果表明基因編碼逡逑區(qū)序列與序列拼接結果一致。三磷酸甘油醛脫氫酶基因的全長序列為１２２３邋ｂｐ，逡逑ＧｅｎＢａｎｋ登錄號為ＫＸ９８６８０１．］，因此可以確定克隆得到了三磷酸甘油醛脫氫酶逡逑基因的全長序列，，將其命名為／0Ｇ／＞￡＞?
【學位授予單位】：延邊大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S567.3

【參考文獻】

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本文編號：2678874