【摘要】：神農(nóng)香菊(Chrysanthemum indicum var.aromaticum)是野菊(Chrysanthemum indicum)的一個新變種,全株主要化學(xué)成分為a-側(cè)柏酮、β-側(cè)柏酮、龍腦等萜類化合物,其花、葉、根均具有濃郁的香氣,是菊屬中罕見的芳香型觀賞花卉。萜類合酶(terpene synthase,TPS)是植物萜類代謝途徑中的一類關(guān)鍵酶,對植物體內(nèi)的芳香物質(zhì)起到重要的調(diào)控作用。本研究欲探究神農(nóng)香菊單萜合酶基因(CiTPS)對植物中單萜物質(zhì)的調(diào)控的作用,通過將CiTPS基因在煙草中過表達(dá),初步探究CiTPS基因的調(diào)控功能,再對野菊進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,以期更好挖掘神農(nóng)香菊的芳香價(jià)值及改善野菊的芳香品質(zhì),同時(shí)也為今后培育色香型俱佳的菊花品種奠定理論基礎(chǔ)。本研究以神農(nóng)香菊為實(shí)驗(yàn)材料,在本實(shí)驗(yàn)室前期神農(nóng)香菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,克隆獲得CiTPS基因,對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;構(gòu)建過表達(dá)植物載體,轉(zhuǎn)化煙草,初步探究了 CiTPS基因的功能;優(yōu)化野菊的遺傳轉(zhuǎn)化體系,最終將CiTPS基因轉(zhuǎn)入野菊中。研究結(jié)果如下:1.克隆獲得的CiTPS基因開放閱讀框(OOF)長度為1818bp,編碼6005氨基酸;該基因具有單萜合酶的典型保守域和功能高度保守序列,即DDXXD、(N,D)D(L,I,V)X(S,T)XXXE和RRX8W,屬于單萜類合酶家族,具有合成單萜物質(zhì)的功能;該基因所編碼的蛋白質(zhì)相對分子量為70.1 1kDa,理論等電點(diǎn)(pI)為5.80,為不穩(wěn)定蛋白,親水性較強(qiáng);多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,CiTPS基因序列與黃花蒿的反式芳樟醇OH1基因序列相似度可以達(dá)到91%,TPS基因?qū)儆赥SPb家族,其編碼的蛋白與黃花蒿和薊中TPS編碼的蛋白同源關(guān)系較近,。2.在已獲得神農(nóng)香菊CiTPS基因的基礎(chǔ)上,雙酶切構(gòu)建了pBI121-TPS-GFP植物過表達(dá)載體,通過電轉(zhuǎn)化法將pBI121-TPS-GFP重組質(zhì)粒和pBI121-GFP空載體質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌中,并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功轉(zhuǎn)入煙草植株體內(nèi)。通過抗性生根篩選、抗性植株DNA和RNA的PCR檢測以及不同煙草株系的qRT-PCR檢測,證明成功獲得6株轉(zhuǎn)CiTPS基因和1株轉(zhuǎn)pBl1 21-GFP空載體的陽性煙草株系,并篩選出3株轉(zhuǎn)CiTPS基因煙草株系,分析其和野生型煙草、轉(zhuǎn)空載煙草T1代葉片在旺盛生長期的分泌物,初步探究出CiTPS基因具有提高植物體內(nèi)單萜物質(zhì)的功能。3.野菊葉盤在含1.0 mg/L 6-BA和0.8 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)效果最佳,其遺傳轉(zhuǎn)化的卡那霉素最適分化臨界耐受濃度為8 mg/L,最適生根臨界耐受濃度為10 mg/L,頭孢霉素抑菌濃度在篩選培養(yǎng)階段選用200 mg/L最佳。葉盤在經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)2 d,侵染10 min,共培養(yǎng)3 d后,遺傳轉(zhuǎn)化效率最高。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CiTPS基因和pBI121-GFP空載體轉(zhuǎn)入野菊,通過生根篩選、抗性植株DNA和RNA的PCR檢測,證明已成功過獲得3株轉(zhuǎn)CiTPS基因和2株轉(zhuǎn)pBI121-GFP空載體的陽性轉(zhuǎn)野菊株系。
【圖文】：

２．３結(jié)果與分析逡逑２．３．１總ＲＮＡ電泳及濃度檢測逡逑神農(nóng)香菊葉片總ＲＮＡ邋（圖２－１）的５邋ｓ、１８邋ｓ和２８邋ｓ三條核糖體帶都清晰可見，說明逡逑所提神農(nóng)香菊葉片ＲＮＡ的完整性好，質(zhì)量較高并且無降解，可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。逡逑瓜—■逡逑圖２－１神農(nóng)香菊ＲＮＡ電泳圖逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｑｕａｎｔｉｔｙ邋ｏｆ邋ｅｘｔｒａｃｔｅｄ邋ｔｏｔｏｌ邋ＲＮＡ邋ｏｆ邋Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ邋ｉｎｄｉｃｕｍ邋ｖａｒ．邋ａｒｏｍａｔｉｃｕｍ逡逑－１２－逡逑

邐２神農(nóng)香菊７ＰＳ基因克隆及生物信息學(xué)分析邐逡逑２．３．２邋７７Ｗ基因克隆與序列分析逡逑以神農(nóng)香菊幼苗葉片總ＲＮＡ經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得的ｃＤＮＡ為模板，利用ＰＣＲ擴(kuò)增獲得目逡逑的片段（圖２－２）。用膠回收試劑盒回收ＰＣＲ產(chǎn)物，將其與ｐＵＣ－Ｔ載體連接后轉(zhuǎn)化大腸逡逑桿菌ＤＨ５ｏｔ菌株感受態(tài)，利用ＰＣＲ擴(kuò)增的方法篩選出１０個陽性克�。▓D２－３），選取３逡逑個條帶亮度好的克隆進(jìn)行測序。結(jié)果顯示，基因序列具有完整的ＯＲＦ，其序列長度為逡逑１８１８ｂｐ，可以編碼６０５個氨基酸的多肽鏈（圖２－４），該序列具有單萜類合酶的典型保守逡逑域和功能高度保守序列，即ＤＤＸＸＤ、（Ｎ，Ｄ）邋Ｄ邋（Ｌ，Ｉ，，Ｖ）邋Ｘ邋（Ｓ，Ｔ）邋ＸＸＸＥ和逡逑ＲＲＸ８Ｗ，這表明所克隆的基因?qū)儆趩屋祁惡厦讣易�，將該基因序列命名為Ｃ／７７＾，并將逡逑序列在ＮＣＢＩ上進(jìn)行登錄，登錄號為ＭＨ１２４７３７。逡逑．．—．逡逑
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S682.11

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 馬轉(zhuǎn)轉(zhuǎn);龐瀟卿;諶容;裴曉林;王秋巖;謝恬;殷曉浦;;萜類化合物生物合成途徑中關(guān)鍵酶的研究進(jìn)展[J];杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2015年06期

2 何淼;高文杰;高耀輝;呂明月;馮博;孫穎;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的神農(nóng)香菊遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J];中藥材;2014年08期

3 王凌健;方欣;楊長青;李建戌;陳曉亞;;植物萜類次生代謝及其調(diào)控[J];中國科學(xué):生命科學(xué);2013年12期

4 吳慧娟;黃楊名;陳科廷;閆云君;徐莉;劉云;;神農(nóng)香菊全草精油的化學(xué)成分及抑菌機(jī)理研究[J];食品科學(xué);2012年17期

5 熊換英;鐘偉光;張壽文;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化影響因素研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年17期

6 何云飛;高偉;劉塔斯;李文淵;黃璐琦;;二萜合酶的研究進(jìn)展[J];藥學(xué)學(xué)報(bào);2011年09期

7 趙伶俐;石少川;張啟翔;高亦珂;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的地被菊遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化[J];分子植物育種;2011年01期

8 謝鑫星;路揚(yáng);梁晶;馬翠;何奕昆;;高效農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J];中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào);2010年01期

9 占愛瑤;由香玲;詹亞光;;植物萜類化合物的生物合成及應(yīng)用[J];生物技術(shù)通訊;2010年01期

10 梁美霞;祝軍;戴洪義;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)柱型蘋果“魯加6號”遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J];分子植物育種;2009年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 周思軍;大豆抗蟲基因轉(zhuǎn)移及其轉(zhuǎn)化系統(tǒng)優(yōu)化研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2000年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 王鋒;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的耐鹽基因EhHOG對大麥幼胚及其愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

2 高耀輝;神農(nóng)香菊DiaMYB基因克隆及功能分析[D];東北林業(yè)大學(xué);2014年

3 劉海礁;法呢基焦磷酸合酶基因（fps）轉(zhuǎn)化煙草的研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

4 梁慧;菊花高頻再生體系建立及根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化[D];西南大學(xué);2006年

本文編號：2679135