【摘要】：研究背景基因水平轉(zhuǎn)移(Horizontal gene transfer,HGT)可導(dǎo)致細(xì)菌不同種屬間個(gè)體DNA的交換,從而使細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性增強(qiáng),是細(xì)菌進(jìn)化的重要途徑之一�；驆u(Genomic Islands,GEIs)是基因水平轉(zhuǎn)移的重要載體�？梢苿�(dòng)的基因島能夠整合到宿主的染色體上,并在特定的條件下切除,進(jìn)而通過轉(zhuǎn)化、接合或轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式轉(zhuǎn)移到新的宿主中,是非�；钴S的移動(dòng)元件�；驆u具有多種生物學(xué)功能,如抗生素抗性、致病性、異源物質(zhì)降解及重金屬抗性等。基因島的轉(zhuǎn)移不僅有助于微生物對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng),而且能夠造成可變基因在不同種屬細(xì)菌間的廣泛傳播,如基因島攜帶的毒力和耐藥基因的傳播導(dǎo)致了致病性的多重耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生,嚴(yán)重威脅人類健康。本研究中所涉及的GIsul2基因島在陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae subspecies)、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)和志賀桿菌(Shigella flexneri)中都有發(fā)現(xiàn)報(bào)道。其中GIsul2基因島不僅攜帶了多重耐藥基因和砷抗性基因而且在GIsul2基因島的尾端存在一個(gè)ISCR2移動(dòng)元件。已有研究表明,ISCR家族移動(dòng)元件與耐藥基因的傳播是存在聯(lián)系的,但其轉(zhuǎn)移調(diào)控機(jī)制仍未闡明,亟待研究。本文對(duì)細(xì)菌中GIsul2基因島的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、轉(zhuǎn)移和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入的研究,揭示了GIsul2基因島的轉(zhuǎn)移和初步的調(diào)控分子機(jī)制,為遏制基因島的傳播提供重要策略。研究目的本文以GIsul2基因島為研究對(duì)象,利用雙質(zhì)粒系統(tǒng)研究該基因島在移動(dòng)過程中可能存在的轉(zhuǎn)移及調(diào)控機(jī)制,探究GIsul2基因島對(duì)細(xì)菌耐藥基因傳播的影響。通過對(duì)GIsul2基因島轉(zhuǎn)移調(diào)控因子功能的進(jìn)一步研究,進(jìn)而找到抑制基因島的轉(zhuǎn)移的手段。從細(xì)菌水平基因轉(zhuǎn)移和基因調(diào)控的角度深入研究病原菌致病性、耐藥性和傳播性的進(jìn)化機(jī)制,為解決細(xì)菌耐藥性問題提供新的理論依據(jù)。研究方法1.以實(shí)驗(yàn)室測(cè)序的Shigella flexneri 51575為研究對(duì)象,通過分子克隆手段獲得大小為15 kb的GIsul2基因島。2.構(gòu)建溫敏供體質(zhì)粒pKD46-GIsul2以及相關(guān)基因敲除型供體質(zhì)粒,同時(shí)構(gòu)建相關(guān)受體pKF18-GMP800。3.將供受體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌感受態(tài)DH5α(recA~-),構(gòu)建雙質(zhì)粒系統(tǒng)檢測(cè)GIsul2基因島轉(zhuǎn)移情況。4.將GIsul2基因島中關(guān)鍵基因通過分子克隆手段構(gòu)建最小轉(zhuǎn)移單元,在雙質(zhì)粒系統(tǒng)中,研究相關(guān)因子的相互作用。5.將引起GIsul2基因島轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白P4-like整合酶通過PCR的方式克隆到原核蛋白表達(dá)載體pET28a載體上,將構(gòu)建成功的克隆轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21(DE3)感受態(tài)中,使用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化P4-like整合酶。設(shè)計(jì)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證P4-like整合酶的功能。研究結(jié)果1.通過PCR、酶切和測(cè)序等手段檢測(cè)到GIsul2基因島的轉(zhuǎn)移,并且GIsul2基因島在轉(zhuǎn)移的同時(shí)能夠介導(dǎo)ISCR2單元的轉(zhuǎn)移。2.基因敲除實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,P4-like整合酶及基因島邊界的正向重復(fù)序列(direct repeats,DRs)對(duì)GIsul2基因島以及ISCR2單元的轉(zhuǎn)移是必須的。3.GIsul2基因島在轉(zhuǎn)移過程中存在fitA、alpa等輔助因子,這些輔助因子能夠調(diào)控GIsul2基因島及ISCR2單元轉(zhuǎn)移頻率和轉(zhuǎn)移形式。4.將P4-like整合酶與DR區(qū)序列通過PCR手段構(gòu)建最小移動(dòng)單元,通過雙質(zhì)粒系統(tǒng)的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)P4-like整合酶與DR區(qū)能夠介導(dǎo)最小單元的轉(zhuǎn)移。5.在最小單元的與相應(yīng)的受體構(gòu)建的雙質(zhì)粒系統(tǒng)中,研究發(fā)現(xiàn)在基因島的邊界處存在大約100 bp的輔助因子結(jié)合序列。6.利用純化的P4-like整合酶進(jìn)行體外酶切實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),P4-like整合酶具有兼性拓?fù)洚悩?gòu)酶的功能,并能夠特異性的結(jié)合到DR序列上。研究結(jié)論1.GIsul2基因島在轉(zhuǎn)移的同時(shí)能夠介導(dǎo)ISCR2單元的轉(zhuǎn)移。在轉(zhuǎn)移的過程中,除了P4-like整合酶和DR序列是必需以外,輔助因子同樣影響GIsul2基因島轉(zhuǎn)移的效率。2.P4-like整合酶能夠結(jié)合到DR序列上通過特異性位點(diǎn)重組從宿主染色上環(huán)出并轉(zhuǎn)移。DR序列周圍存在輔因子結(jié)合的靶位點(diǎn),生物信息分析發(fā)現(xiàn)DNA靶序列的同源性較低,但二級(jí)結(jié)構(gòu)存在較高的相似性。推測(cè)復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)能夠使P4-like整合酶更精準(zhǔn)地識(shí)別與結(jié)合DR序列。
【圖文】：

基因島不同類型Fig1.1Variabletypesofgenomicisland.

基因組島的基本特征
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q78;Q933

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 張霖;趙國(guó)屏;丁曉明;;位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的機(jī)理和應(yīng)用[J];中國(guó)科學(xué):生命科學(xué);2010年12期

2 ;Innovation for ascertaining genomic islands in PAO1 and PA14 of Pseudomonas aeruginosa[J];Chinese Science Bulletin;2009年21期

3 鄧玉婷;曾振靈;劉健華;陳杖榴;;插入序列共同區(qū)元件:細(xì)菌中新出現(xiàn)的一種基因捕獲系統(tǒng)[J];微生物學(xué)報(bào);2009年08期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 周純葆;基因島預(yù)測(cè)與隔離遷移模型并行化[D];吉林大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 袁璐;可移動(dòng)元件整合子與細(xì)菌多重耐藥性的關(guān)系研究[D];中南大學(xué);2014年

2 王鳳平;1800株G-桿菌插入序列共同區(qū)和整合子的耐藥機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

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本文編號(hào)：2678622