【摘要】：背景:肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均較高的惡性疾病之一,而非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)是其最常見(jiàn)的類型,約占所有肺癌病例的80%。肺癌常規(guī)的治療方法包括外科治療、放射治療、化學(xué)治療,隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展,靶向治療正在逐步成為肺癌的主要治療手段之一。因此,尋找NSCLC發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵基因和相關(guān)信號(hào)通路,并揭示其中的分子機(jī)制,對(duì)于NSCLC靶向治療至關(guān)重要。研究者們先已發(fā)現(xiàn)了許多在NSCLC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起決定作用的癌基因和癌相關(guān)蛋白,為治療提供了新的研究和治療思路。水通道蛋白5(Aquaporin 5,AQP5)一種跨細(xì)胞膜的水通道蛋白,具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)水平衡的作用。近期有研究表明,AQP5在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),可促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖,對(duì)其進(jìn)行基因沉默可抑制腫瘤生長(zhǎng)。但AQP5與NSCLC之間的相關(guān)性仍有待探索。目的:在國(guó)內(nèi)外研究的基礎(chǔ)上,通過(guò)基因工程重組技術(shù)沉默AQP5基因在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá),系統(tǒng)評(píng)價(jià)AQP5對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖凋亡、遷徙侵襲等生物學(xué)功能的影響,并進(jìn)一步探討AQP5基因沉默后對(duì)相關(guān)功能蛋白的及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響,闡述AQP5與NSCLC發(fā)生發(fā)展的密切關(guān)系及相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及分子機(jī)制,為NSCLC的治療提供新靶點(diǎn)。方法:1.Western Blot方法檢測(cè)正常人肺細(xì)胞MRC-5和人肺癌細(xì)胞系HCC827、A549、H1299、H358中AQP5的表達(dá)水平,篩選出AQP5高表達(dá)細(xì)胞系A(chǔ)549。設(shè)計(jì)并構(gòu)建特異性真核表達(dá)質(zhì)粒AQP5-p GCH1/Neo和陰性質(zhì)粒NC-p GCH1/Neo,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞,構(gòu)建AQP5基因沉默細(xì)胞及陰性對(duì)照組細(xì)胞。Real-time PCR和Western Blot方法檢測(cè)并比較未處理細(xì)胞組、陰性對(duì)照組及基因沉默組細(xì)胞的AQP5基因和蛋白表達(dá)水平。2.利用細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn),MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力,采用流式細(xì)胞術(shù)考察細(xì)胞周期分布及細(xì)胞凋亡差異;Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白Bcl-2、Cleaved caspased-3和Bax的表達(dá)情況。3.劃痕實(shí)驗(yàn)觀察三組細(xì)胞的遷移能力,Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察侵襲能力,Western Blot法檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-2,MMP-9和Vimentin表達(dá)水平。4.利用Western Blot對(duì)ERK1/2信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-ERK、p-CREB和c-fos表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),探討AQP5對(duì)ERK1/2信號(hào)通路的影響。5.在上述體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,將未處理細(xì)胞組、陰性對(duì)照組及基因沉默組三組細(xì)胞接種于裸鼠皮下,建立體內(nèi)異種移植瘤模型,觀察體內(nèi)情況下AQP5表達(dá)下調(diào)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡影響。結(jié)果:1.成功構(gòu)建含有AQP5 sh RNA的AQP5-p GCH1/Neo質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒NC-p GCH1/Neo,并轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞;轉(zhuǎn)染AQP5-p GCH1/Neo質(zhì)粒的A549細(xì)胞中AQP5基因和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。2.細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)表明,AQP5 sh RNA組形成細(xì)胞集落能力顯著下降;MTT實(shí)驗(yàn)表明AQP5 sh RNA細(xì)胞組各時(shí)間點(diǎn)吸光度均降低,時(shí)間越長(zhǎng),差異越顯著。流式細(xì)胞儀結(jié)果表明AQP5 sh RNA組細(xì)胞阻滯在G0/G1期,而在S期、G2/M期細(xì)胞數(shù)量顯著減低,并且凋亡顯著。凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示AQP5 sh RNA組Bcl-2表達(dá)下調(diào),Cleaved caspased-3和Bax表達(dá)上調(diào),Bcl-2/Bax比值降低,說(shuō)明AQP5基因沉默抑制腫瘤細(xì)胞增殖,阻滯細(xì)胞周期,抑制腫瘤細(xì)胞分裂,并可通過(guò)調(diào)控Bcl-2家族凋亡相關(guān)蛋白促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。3.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示AQP5 sh RNA組細(xì)胞遷移能力下降。Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)表明AQP5 sh RNA組進(jìn)入下層小室細(xì)胞減少,侵襲能力下降。Western Blot結(jié)果顯示腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)鍵因子MMP-2和MMP-9和間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白Vimentin表達(dá)降低,說(shuō)明AQP5表達(dá)下調(diào)降低腫瘤細(xì)胞侵襲能力,抑制腫瘤細(xì)轉(zhuǎn)移。4.AQP5 sh RNA組細(xì)胞p-ERK、p-CREB和c-fos表達(dá)量均顯著降低。說(shuō)明AQP5表達(dá)下調(diào)可降低ERK1/2信號(hào)通路蛋白磷酸化,抑制ERK1/2信號(hào)通路。5.AQP5 sh RNA組小鼠的腫瘤體積、重量顯著小于對(duì)照組,腫瘤生長(zhǎng)速度明顯下降;Tunel法檢測(cè)腫瘤凋亡結(jié)果顯示AQP5 sh RNA組小鼠腫瘤組織中凋亡細(xì)胞更多。說(shuō)明在體內(nèi)環(huán)境下,AQP5基因沉默可抑制腫瘤增殖,促進(jìn)腫瘤凋亡。結(jié)論:1.使用RNAi技術(shù)建立了非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的AQP5基因沉默細(xì)胞系。2.證實(shí)AQP5與非小細(xì)胞肺癌A549生物學(xué)功能關(guān)系密切,表達(dá)下調(diào)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,并能調(diào)控相關(guān)功能蛋白的表達(dá)水平,對(duì)ERK1/2信號(hào)通路有抑制作用。3.為非小細(xì)胞肺癌的診斷和治療提供新的潛在標(biāo)志物及靶點(diǎn)。4.為RNA干擾技術(shù)治療腫瘤疾病提供實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)。
【圖文】：

圖 1 AQP5 結(jié)構(gòu)示意圖[94]顯示 AQP5 的基本單體Fig1 structure diagram display the basic monomer of AQP52.2 AQP5 的調(diào)控機(jī)制尚未完全了解 AQP5 蛋白表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制。然而，已知 AQP5 基因的啟

圖 1.1 pGCsi-H1/Neo/GFP 質(zhì)粒圖譜ure 1.1 Plasmid Profile of pGCsi-H1/Neo析比對(duì)，表明插入序列與設(shè)計(jì)序列完全粒。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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2 高原;陳奇;王瑩;劉贊;于丹;潘茜;劉春英;;補(bǔ)中益氣湯對(duì)A549荷瘤裸鼠移植瘤survivin mRNA及蛋白表達(dá)的影響[J];中華中醫(yī)藥雜志;2017年02期

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本文編號(hào)：2678064