【摘要】：黑曲霉是工業(yè)生產(chǎn)中常用的絲狀真菌。本研究的研究對(duì)象黑曲霉SH2、HL_1具有不產(chǎn)孢子、蛋白分泌能力強(qiáng)等特點(diǎn),并且可以進(jìn)行高密度發(fā)酵在大規(guī)模發(fā)酵中應(yīng)用廣泛。第三代基因組測(cè)序技術(shù)即單分子測(cè)序技術(shù),沒(méi)有PCR擴(kuò)增,杜絕了擴(kuò)增引入堿基的錯(cuò)誤,同時(shí)以其獨(dú)特的讀長(zhǎng)特點(diǎn),顯著減少后續(xù)的基因拼接以及提高功能注釋的質(zhì)量,在基因組測(cè)序中具有顯著的優(yōu)勢(shì)。本研究應(yīng)用第三代單分子測(cè)序技術(shù),對(duì)黑曲霉SH2和黑曲霉HL_1進(jìn)行測(cè)序,通過(guò)組裝、功能基因注釋,分別將這兩菌株和黑曲霉CBS513.88進(jìn)行比較基因組學(xué)研究,從基因和功能蛋白表達(dá)等方面闡述兩株菌的遺傳學(xué)特性。本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下。1.黑曲霉SH2、HL_1基因組組裝及功能基因注釋基于Pac Bio平臺(tái),應(yīng)用第三代單分子技術(shù)對(duì)黑曲霉SH2和黑曲霉HL_1進(jìn)行全基因組測(cè)序,獲得原始reads,用Celera、Falcon軟件分別進(jìn)行組裝,獲得最優(yōu)結(jié)果,其中黑曲霉SH2獲得11個(gè)Scaffold,基因組大小為34.4Mb,基因11348個(gè),外顯子35883個(gè),蛋白質(zhì)編碼區(qū)11348個(gè),t RNA 317個(gè),r RNA 57個(gè),s RNA 62個(gè),sn RNA 28個(gè),mi RNA170個(gè),GC含量49.74%。黑曲霉HL_1獲得28個(gè)contigs,基因組大小為34.6 Mb,基因10821個(gè),外顯子35582個(gè),蛋白質(zhì)編碼區(qū)10821個(gè),t RNA300個(gè),s RNA4個(gè),sn RNA18個(gè),GC含量49.49%。2.黑曲霉菌株SH2、HL_1與模式菌株CBS513.88的比較基因組分析將黑曲霉SH2、HL_1的基因組序列與黑曲霉模式菌株CBS513.88進(jìn)行核苷酸層次以及蛋白質(zhì)層次的同源性分析,通過(guò)比對(duì)得出三菌株的基因組成差異以及兩菌株所缺失的基因,并通過(guò)PCR驗(yàn)證生物信息學(xué)的分析結(jié)果,完善黑曲霉SH2和HL_1的基因組信息。其中,與黑曲霉菌株孢子發(fā)育相關(guān)的核心基因是An18g01170(Prp A),模式菌株CBS513.88存在該基因,將黑曲霉SH2和黑曲霉HL_1與模式菌株進(jìn)行全基因組比對(duì),比對(duì)結(jié)果顯示黑曲霉SH2缺少該基因,而黑曲霉HL_1存在該基因,并且與CBS513.88是100%匹配,這與SH2菌株無(wú)孢子的表型以及HL_1產(chǎn)少量孢子的表型吻合。同時(shí),兩菌株在蛋白質(zhì)翻譯表達(dá)方面的基因富集較多,從理論上論證SH2和HL_1能夠成為工業(yè)生產(chǎn)中異源蛋白表達(dá)宿主的原因。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示,SH2與ATCC-1015親緣關(guān)系較近,HL_1與CBS513.88親緣關(guān)系較近,該結(jié)果為明確工業(yè)黑曲霉菌株之間的親緣關(guān)系以及進(jìn)化演變地位提供理論支持。3.對(duì)黑曲霉SH2、HL_1關(guān)鍵代謝基因的注釋與分析黑曲霉SH2和黑曲霉HL_1是工業(yè)生產(chǎn)細(xì)菌,用于糖化酶生產(chǎn)以及異源表達(dá)宿主,對(duì)與蛋白翻譯轉(zhuǎn)錄以及分泌相關(guān)的基因簇聚類有重要工業(yè)價(jià)值,本研究主要對(duì)蛋白水解酶基因簇、多糖降解酶基因簇、轉(zhuǎn)錄因子基因簇、次級(jí)代謝基因簇以及與細(xì)胞壁相關(guān)基因簇進(jìn)行聚類,并且構(gòu)建了兩株黑曲霉的中心代謝網(wǎng)絡(luò),這些信息對(duì)于利用基因修飾工術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行改造,從而進(jìn)一步提高其蛋白分泌量有一定的參考價(jià)值。通過(guò)對(duì)兩株黑曲霉的密碼子使用頻率進(jìn)行分析,獲得了兩株菌蛋白基因高表達(dá)高使用頻率密碼子ATG(甲硫氨酸,Met)、TGG(色氨酸,Trp),為工業(yè)菌株密碼子優(yōu)化及其改造提供參考。本論文旨在利用第三代單分子技術(shù)對(duì)兩株黑曲霉SH2和HL_1進(jìn)行全基因組測(cè)序,并進(jìn)行功能預(yù)測(cè)以及注釋,分析所有基因功能,充分了解兩株黑曲霉的遺傳特性、轉(zhuǎn)錄、以及表達(dá)等特點(diǎn)和機(jī)理,通過(guò)比較基因組學(xué)的研究,完善兩菌株的基因?qū)用娴男畔?為現(xiàn)代化的工業(yè)生產(chǎn)提供遺傳信息支持,同時(shí)也為微生物基因組學(xué)的研究提供技術(shù)以及數(shù)據(jù)分析參考。構(gòu)建了這兩株高產(chǎn)糖化酶黑曲霉的中心代謝途徑,并對(duì)其蛋白水解酶基因簇、多糖降解酶、次級(jí)代謝基因簇、與細(xì)胞壁相關(guān)基因簇聚類,這些基因簇與蛋白的表達(dá)或者分泌有一定的聯(lián)系,同時(shí)也對(duì)兩株菌的密碼子偏好性進(jìn)行分析,這對(duì)于菌株改造、基因修飾或者密碼子優(yōu)化有一定的指導(dǎo)作用,對(duì)于進(jìn)一步提高蛋白的產(chǎn)量有重要意義。
【圖文】：

圖 1-1 黑曲霉分生孢子梗的掃描電鏡圖[1]Fig. 1-1 Scanning electron microscope photo of Aspergillus niger conidial head[1]黑曲霉工業(yè)應(yīng)用霉是重要的工業(yè)菌株，由于其獨(dú)特的生理特性以及強(qiáng)大且豐富的降解酶系適應(yīng)多種培養(yǎng)環(huán)境，并且能快速生長(zhǎng)發(fā)酵，及時(shí)在 pH 數(shù)值較低的環(huán)境中盛的代謝活性，同時(shí)不易受到雜菌污染，廣泛用于有機(jī)酸和生物制劑生產(chǎn)上常見(jiàn)的淀粉酶、纖維素酶、葡萄糖酶、木聚糖酶[3]、單寧酶、植酸酶[4]等不同成分的培養(yǎng)基產(chǎn)生不同的酶制品組合。酶制品外，黑曲霉還應(yīng)用于檸檬酸的生產(chǎn)中，而檸檬酸制藥、飲品等領(lǐng)域原料，目前全世界生產(chǎn)的檸檬酸中，超過(guò) 90%是由黑曲霉發(fā)酵獲得。另外食子等有機(jī)酸的生產(chǎn)菌株。霉在低 pH 中旺盛的代謝活性，可在廢水處理中用來(lái)降解有機(jī)物質(zhì)，其胞

圖 2-4 生物信息學(xué)分析技術(shù)路線Fig. 2-4 Bioinformatics analysis technology route2.2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1 黑曲霉 SH2 和 HL_1 的 DNA 提取及測(cè)序兩菌株 SH2 和 HL_1 基因組的提取主要參考 Raeder[47]等發(fā)表的方法,測(cè)序是應(yīng)用PacBio 平臺(tái)，，主要的方法和步驟如下：1）首先收集 DPY 培養(yǎng)基中黑曲霉 SH2 和 HL_1 菌絲，去除培養(yǎng)基雜質(zhì)2）分別轉(zhuǎn)移 SH2 和 HL_1 菌絲體至研缽內(nèi)，液氮下均勻研磨，接著加入適量溶菌緩沖液3）分別加入等體積氯仿：苯酚：異戊醇（24:25:1）混合液后分別抽提 DNA 兩次4）分別吸取上清液（V:代表體積）加入到 2 倍體積無(wú)水乙醇（absolute ethyl alcohol）中，-20。C 沉淀 2 h
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳小斌;陳國(guó)慶;喬寵;;轉(zhuǎn)錄因子在滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)行為調(diào)控中的作用[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2018年03期

2 烏日拉嘎;徐海燕;馮淑貞;孫志宏;孟和畢力格;張和平;;測(cè)序技術(shù)的研究進(jìn)展及三代測(cè)序的應(yīng)用[J];中國(guó)乳品工業(yè);2016年04期

3 隋雨菲;歐陽(yáng)立明;魯洪中;莊英萍;張嗣良;;黑曲霉組學(xué)研究進(jìn)展[J];生物工程學(xué)報(bào);2016年08期

4 田李;張穎;趙云峰;;新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用[J];生物技術(shù)通報(bào);2015年11期

5 劉新育;王一凡;王明道;陳紅歌;;熱擊對(duì)黑曲霉孢子萌發(fā)及產(chǎn)木聚糖酶的影響[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2013年11期

6 李亦學(xué);李軒;;新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用[J];中國(guó)科技投資;2012年07期

7 李文;王陶;李同祥;;氯化鋰誘變黑曲霉原生質(zhì)體選育高產(chǎn)植酸酶菌株[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2012年02期

8 楊曉玲;施蘇華;唐恬;;新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用前景[J];生物技術(shù)通報(bào);2010年10期

9 郭艷梅;鄭平;孫際賓;;黑曲霉作為細(xì)胞工廠:知識(shí)準(zhǔn)備與技術(shù)基礎(chǔ)[J];生物工程學(xué)報(bào);2010年10期

10 彭翼飛;馬文麗;;寡核苷酸陣列比較基因組雜交技術(shù)及其應(yīng)用[J];中國(guó)生物工程雜志;2006年10期

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 李達(dá)

本文編號(hào)：2678110