【摘要】：近年來水稻生產(chǎn)中一直面臨著病蟲害的危害,其中二化螟、三化螟的危害最為嚴重,主要原因在于目前在水稻中還沒有發(fā)現(xiàn)抗螟蟲的品種,抗螟蟲基因的挖掘和定位一直進展緩慢。通過轉基因技術將Bt基因導入水稻中獲得具有抗蟲性的轉基因株系是當前解決問題的主要途徑。通過分子生物學方法進一步了解轉基因株系中Bt基因的表達規(guī)律,有利于全面地了解品種的抗蟲特性,對指導水稻生產(chǎn)應用提供了參考依據(jù)。然而對于轉基因技術,學界和社會一直存在著許多擔憂,其中基因的插入在獲得目標性狀的同時,是否會引起其他非預期效應,從而造成安全性問題,是目前面臨的主要問題之一。1、采用NCII不完全雙列雜交配制35個組合,通過配合力分析得到配合力強的親本和優(yōu)良雜交組合。親本的一般配合力(GCA)效應分析表明洪A、荃9311A、昌恢121T、昌恢T025T的GCA效應值高;雜交組合的特殊配合力(SCA)效應分析表明,荃9311A/昌恢T025T的9個農(nóng)藝性狀綜合SCA效應值最好;67A/R205T的單株產(chǎn)量SCA效應值最高;荃9311A/昌恢606T具有最小的株高SCA效應值;穗長SCA效應值最大的是843A/昌恢891T;843A/昌恢121T的空批粒數(shù)SCA效應值最低,結實率SCA最高。荃9311A/昌恢T025T、67A/R205T、洪A/昌恢121T、843A/昌恢121T為優(yōu)良雜交組合;2、利用實時熒光定量PCR研究cry1C、cry2A在新抗蟲恢復系及其F_1內的時空表達規(guī)律,新抗蟲恢復系及其F_1中cry1C、cry2A的基因表達情況如下:在葉片和莖稈中cry1C和cry2A表達量在分蘗期、幼穗分化期逐漸增加,直到抽穗期達到最高峰,灌漿期一直維持著較高的表達量,進入成熟期后迅速降低;在穗中cry1C和cry2A表達量從幼穗分化期開始逐漸增加,直到抽穗期達到最高峰,進入灌漿期后迅速下降,說明cry1C和cry2A在整個生長周期內的表達呈現(xiàn)前高后低的趨勢,而且表達過程持續(xù)性強;從分蘗期至成熟期cry1C和cry2A表達量在葉片組織莖稈組織穗組織胚乳組織,說明cry1C和cry2A基因主要在稻縱卷葉螟和二化螟的主要危害部位表達;在親代恢復系中cry1C和cry2A表達量要遠遠高于雜交組合F1,說明cry1C和cry2A可能存在某種形式的劑量效應;雙價抗蟲水稻cry1C、cry2A表達量低于單價抗蟲水稻,并且表達規(guī)律復雜,說明cry1C、cry2A可能存在形式復雜多樣的互作效應;在不同品種間cry1C、cry2A表達量存在一定差異,說明抗蟲基因表達可能與水稻遺傳背景緊密相關;3、Elisa檢測Bt蛋白在新抗蟲恢復系及其F_1內的時空表達規(guī)律,并對新抗蟲恢復系及其F_1進行室內喂蟲實驗計算螟蟲致死率,新抗蟲恢復系及其F_1中Bt蛋白的表達情況和螟蟲致死率如下:Bt蛋白的表達量均為抽穗期葉片分蘗期葉片,cry1C蛋白表達量的變化范圍1.82ug/g~4.95ug/g,cry2A蛋白表達量的變化范圍6.52ug/g~7.39ug/g,在接蟲48h后二齡二化螟的螟蟲致死率均為抽穗期葉片分蘗期葉片,螟蟲致死率變化范圍75%~85%;Bt蛋白的表達量均為抽穗期葉片抽穗期莖稈,cry1C蛋白表達量的變化范圍0.16ug/g~4.95ug/g,cry2A蛋白表達量的變化范圍0.31ug/g~7.39ug/g,而在接蟲48h后二齡二化螟的螟蟲致死率均為抽穗期莖稈抽穗期葉片,螟蟲致死率變化范圍75%~95%,研究發(fā)現(xiàn)在葉片中cry1C蛋白含量的最低致死閾值≤2.2ug/g,cry2A蛋白含量的最低致死閾值≤6.52ug/g;在莖稈中cry1C蛋白含量的最低致死閾值≤0.16ug/g,cry2A蛋白含量的最低致死閾值≤0.31ug/g;4、通過反向PCR擴增側翼序列,再用巢式PCR對擴增產(chǎn)物進行富集,將產(chǎn)物進行測序,序列比對日本晴全基因組,結果發(fā)現(xiàn)cry1C側翼序列片段大小為1276bp,定位在水稻11號染色體上,cry2A側翼序列片段大小為948bp,定位在水稻12號染色體上;5、用216對SSR引物對實驗組和對照組進行全基因組背景分析,昌恢121T、昌恢891T、昌恢T025T、R205選T的遺傳背景回復率分別為95.60%、88.43%、93.52%、94.44%,4個恢復系已經(jīng)基本恢復輪回親本的主要特性;6、根據(jù)cry1C、cry2A的插入位點設計側翼基因的跨內含子引物,real-time PCR檢測外源基因插入位點上下游100Kb內9個基因的表達差異,結果表明實驗組和對照組在cry1C、cry2A插入位置上下游100kb內9個側翼基因的表達水平?jīng)]有顯著性差異;考察相關農(nóng)藝性狀發(fā)現(xiàn)實驗組和對照組在光合特性與產(chǎn)量表型上沒有顯著性差異,研究進一步表明,cry1C和cry2A的插入不會引起側翼基因表達水平的改變,轉基因水稻在相關農(nóng)藝性狀上并未產(chǎn)生非預期效應。
【圖文】：

圖 1 2017 年全球商業(yè)化種植轉基因農(nóng)作物的種類和分布Fig1 Type and location of commercially grown genetically engineered crops in 20172 轉基因水稻的研究進展2.1 轉基因水稻的發(fā)展現(xiàn)狀轉基因水稻的發(fā)展要晚于其他轉基因作物，主要原因在于水稻轉基因技術的建立較為困難，日本科學家 Fujimoto 等將 cry1Ab 導入粳稻中和 Wunn 等將 cry1Ab 導入秈稻品種中，標志著轉基因技術在水稻作物改良中的日趨成熟[12-13]。在中國，，主要害蟲包括稻飛虱、螟蟲、稻癭蚊和稻薊馬等，轉基因水稻的培育是當前抵御蟲害的主要措施之一[14-15]，1994 年浙江大學首次在利用農(nóng)桿菌轉化法將 cry1Ab 基因導入秀水 11中[16]；2006 年華中農(nóng)業(yè)大學將改良后的 cry1C 和 cry2A 基因與 rbcS 基因融合后導入水稻植株中，讓 Bt 蛋白僅在綠色組織中表達，大大提高了轉 Bt 基因水稻的食用安全性[17]。然而，在轉基因水稻的應用推廣上，我國還需進一步完善技術體系、人才體系和市場體系，尤其在基因的功能驗證與價值評價等中間環(huán)節(jié)和轉化事件上的技術完善是當前我國轉基因產(chǎn)業(yè)化迫切需要解決的核心問題；在品種特性上，轉基因水稻的目標性狀較單一；在品種研發(fā)上，轉基因水稻的研發(fā)與推廣分離導致品種的選育與市場

ELISA 即酶聯(lián)免疫吸附法是目前應用最廣泛的免疫檢測方法，它的基本原理原抗體的特異性結合和酶對底物的高效催化，由瑞典 Egnvan 和 Perlmann 與荷蘭Vanweeman 和 SehuurS 在 1971 年分別創(chuàng)立。近十年來，科學界們利用 ELISA 法Bt 蛋白在轉基因作物中的表達含量。Voller 等最早將 ELISA 技術應用于蘋果花葉毒（Apple Mosaic Virus，ApMV）的檢測[80]；Clark 等將 ELISA 技術應用于南芥葉病毒（Arabis Mosaic Virus，ArMV）和李痘病毒（Plum Pox Virus，PPV）的檢標志著 ELISA 技術正式應用到植物蛋白檢測上[81]；Shah 等最早建立了雙抗體夾ELISA 法用于檢測轉基因棉花中 Cryl Ac 蛋白[82]；我國 ELISA 檢測法的研究開始陳松、王保民、沈法富等對于轉基因抗蟲棉中 ICPs 表達量的檢測[83-85]；王碩等開出了 Bt 棉花中 CrylAc 蛋白的雙抗夾心 ELISA 檢測方法，該 ELISA 檢測體系中抗體為多抗[86]；轉基因水稻中外源蛋白的檢測體系研究稍晚，2001 年謝小波等用劑盒檢測了轉 Cry1Ab 基因的克螟稻 1 號和克螟稻 2 號及未轉化的秀水 11 米粒中Bt 蛋白含量，結果的相關性非常理想[87]。之后有關 ELISA 檢測 Bt 毒蛋白含量的陸續(xù)開始。5 側翼序列的分離方法
【學位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S511

【參考文獻】

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1 張文蔚;趙潔;李云河;陳秀萍;簡桂良;彭于發(fā);齊放軍;;轉錄組分析轉基因水稻華恢1號地上及地下部分不存在非預期效應（英文）[J];農(nóng)業(yè)生物技術學報;2015年07期

2 劉喜;周春雷;任雅琨;楊春艷;何旎清;柳周;江玲;萬建民;;水稻葉色白化轉綠突變體WGL的遺傳分析與基因定位[J];南京農(nóng)業(yè)大學學報;2015年05期

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6 何煒;朱永生;連玲;周平;蔡秋華;王穎Y

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