【摘要】：1.目的陽春砂Amomum villosum Lour.的干燥成熟果實稱為砂仁,是廣東的道地藥材之一,具有溫脾止瀉、化濕開胃、理氣安胎的功效。本課題組前期已經(jīng)對不同成熟時期和經(jīng)過茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的陽春砂進行了轉(zhuǎn)錄組測序,并篩選出了多個預(yù)測與陽春砂揮發(fā)性萜類合成相關(guān)的萜類合酶和轉(zhuǎn)錄因子基因,本論文對已克隆的單萜合酶基因AvTPS1和AvTPS3進行功能鑒定,并對兩個轉(zhuǎn)錄因子AvMYC2、AvMYC4b基因進行克隆、蛋白純化及原核表達,以進一步認識陽春砂的萜類次生代謝途徑中的關(guān)鍵基因。2.方法2.1 AvTPS1、AvTPS3的功能鑒定2.1.1蛋白原核表達及酶促反應(yīng)以課題組前期克隆的AvTPS1和AvTPS3為基礎(chǔ),利用In-fusion反應(yīng)將去除轉(zhuǎn)運肽的編碼區(qū)構(gòu)建到帶雙His標簽的原核表達載體pET32a上,利用大腸桿菌Rosetta表達菌株進行原核表達,利用Ni-NTA柱純化重組蛋白AvTPS1和AvTPS3,進行酶促反應(yīng)并利用GC-MS進行產(chǎn)物檢測。2.1.2亞細胞定位利用In-fusoin反應(yīng)將AvTPS1和AvTPS3的編碼區(qū)構(gòu)建到瞬時表達載體pAN580上,用酶解法分離獲得煙草Nicotiana tabacum原生質(zhì)體,通過PEG介導(dǎo)法將重組載體轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體,利用激光共聚焦顯微鏡觀察AvTPS1和AvTPS3在植物細胞內(nèi)的定位。2.1.3實時熒光定量PCR和陽春砂揮發(fā)性萜類的測定以陽春砂45 DAF(Days After Flower)和75 DAF的果實(分為果皮和種子團)以及葉、根、匍匐莖為材料,分別提取陽春砂總RNA并反轉(zhuǎn)錄,利用實時熒光定量PCR法測定基因相對表達量;用超聲提取法和GC-MS測定陽春砂上述組織部位的揮發(fā)性萜類含量。對AvTPS1和AvTPS3在陽春砂不同組織部位的基因相對表達量與相關(guān)的揮發(fā)性單萜含量進行分析。2.1.4啟動子的克隆及活性分析從陽春砂葉片基因組DNA(gDNA)中克隆AvTPS1、AvTPS3基因,再根據(jù)AvTPS1和AvTPS3 gDNA序列設(shè)計引物,通過FPNI-PCR的方法從陽春砂葉片gDNA中克隆啟動子并進行序列分析,構(gòu)建由該啟動子驅(qū)動GUS基因的重組表達載體pCAMBIA-AvTPS1p,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染煙草Nicotiana benthamiana葉片,進行瞬時表達驗證AvTPS1啟動子的活性。2.2轉(zhuǎn)錄因子AvMYC2、AvMYC4b的克隆及原核表達以轉(zhuǎn)錄組中AvMYC2(Unigene0136713)和AvMYC4b(Unigene0074125)為目標基因分別通過普通PCR和RACE進行克隆。再利用In-fusion構(gòu)建表達載體pMAL-C5X-AvMYC2及pET32a-AvMYC4b,并將其轉(zhuǎn)化進Rosetta菌株進行蛋白表達,分別利用MBP標簽和Ni-NTA柱進行蛋白純化。3.結(jié)果3.1陽春砂單萜合酶AvPS和AvBPPS的功能鑒定3.1.1 AvTPS1和AvTPS3的體外蛋白功能通過原核表達和分離純化,獲得AvTPS1和AvTPS3重組蛋白。經(jīng)過體外酶活鑒定,AvTPS1催化GPP底物生成α-蒎烯(36.69%)和β-蒎烯(63.31%),將其命名為蒎烯合酶(pinene synthase,AvPS)。重組蛋白AvTPS3以GPP為底物,產(chǎn)物經(jīng)過堿性磷酸酶處理后,通過GC-MS檢測到龍腦基二磷酸脫磷酸后的產(chǎn)物龍腦(65.91%),以及莰烯(17.31%)、β-月桂烯(3.63%)和檸檬烯(13.14%),因此,按其主產(chǎn)物將AvTPS3命名為龍腦基二磷酸合酶(bornyl diphosphate synthase,AvBPPS)。3.1.2 AvPS和AvBPPS的亞細胞定位通過亞細胞定位實驗,發(fā)現(xiàn)AvPS和AvBPPS均定位于葉綠體,符合生物信息學(xué)的預(yù)測和單萜合酶定位于質(zhì)體的特點。3.1.3 AvPS和AvBPPS在陽春砂不同組織中的表達量與相關(guān)揮發(fā)性萜類的分析實時熒光定量PCR結(jié)果顯示AvPS主要在果皮中表達,特別是在45 DAF的果皮中高表達,其他組織有少量表達,而在種子團中不表達。AvBPPS在種子團中高表達,特別是在45 DAF的種子團中顯著高表達,而在其他組織的表達水平較低。揮發(fā)性萜類測定的結(jié)果表明陽春砂含有豐富的揮發(fā)性萜類,特別是單萜�？偣矙z測到15種單萜化合物、9種倍半萜化合物,其中乙酸龍腦酯在藥用部位種子團中顯著富集(占總單萜相對含量(29)50%)。果皮、根、匍匐莖和葉中均檢測到α-蒎烯和β-蒎烯,與AvPS的表達相符,因此推測AvPS參與陽春砂果皮、根、匍匐莖和葉中蒎烯的合成。由于蒎烯是與生物防御相關(guān)的萜類化合物,結(jié)合AvPS在果皮中的高表達和蒎烯在果皮中的高含量,推測AvPS可能參與陽春砂的生物防御。由于AvBPPS的主產(chǎn)物龍腦基二磷酸是龍腦、樟腦和乙酸龍腦酯的關(guān)鍵前體,本文分析了陽春砂揮發(fā)性萜類中與AvBPPS直接和間接相關(guān)的6種揮發(fā)性萜類(莰烯、檸檬烯、β-月桂烯和龍腦、樟腦、乙酸龍腦酯),發(fā)現(xiàn)AvBPPS在種子團中的高表達與這6種揮發(fā)性萜類,特別是乙酸龍腦酯,在種子團中的富集相關(guān),推測AvBPPS是陽春砂主要藥效物質(zhì)乙酸龍腦酯下游生物合成途徑的關(guān)鍵酶。3.1.4陽春砂AvPS和AvBPPS gDNA的克隆以及AvPS啟動子的克隆和鑒定獲得了AvPS和AvBPPS的gDNA,序列長度分別為2 444 bp和2 374 bp,經(jīng)過序列比對發(fā)現(xiàn)它們均含有7個外顯子和6個內(nèi)含子。通過FPNI-PCR獲得568 bp的AvPS啟動子序列,其含有10種順式作用元件,包括啟動子保守元件TATA-box和CAAT-box以及可被轉(zhuǎn)錄因子MYC結(jié)合的G-box,推測AvPS受MYC類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。瞬時表達結(jié)果證明AvPS啟動子啟動了GUS基因的表達,具有啟動子的功能。3.2陽春砂轉(zhuǎn)錄因子AvMYC2、AvMYC4b的克隆與原核表達克隆獲得陽春砂MYC轉(zhuǎn)錄因子AvMYC2和AvMYC4b。AvMYC2的cDNA序列全長2 075 bp,包含171 bp的5’UTR,1644 bp的ORF和260 bp的3’UTR,編碼547個氨基酸,預(yù)測蛋白大小為59 kDa。AvMYC4b全長2 579 bp,包含195bp的5’UTR,1 995 bp的ORF和389 bp的3’UTR,編碼664個氨基酸,預(yù)測蛋白大小為72 kDa。經(jīng)過生物信息學(xué)分析,AvMYC2、AvMYC4b氨基酸序列與其他植物的MYC相似,含有轉(zhuǎn)錄因子MYC家族的保守結(jié)構(gòu)域,預(yù)測可定位于細胞核中。成功構(gòu)建重組表達載體pMAL-C5X-AvMYC2及pET32a-AvMYC4b,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)細胞,經(jīng)過誘導(dǎo)表達與純化,獲得重組蛋白,與預(yù)測蛋白大小一致。4.結(jié)論本文鑒定了單萜合酶AvPS和AvBPPS的功能,AvPS生成α-蒎烯和β-蒎烯;AvBPPS以龍腦基二磷酸為主產(chǎn)物,以莰烯、β-月桂烯、檸檬烯為次要產(chǎn)物。AvPS和AvBPPS均定位于葉綠體中。AvBPPS參與乙酸龍腦酯、龍腦、樟腦、莰烯、β-月桂烯、檸檬烯的生物合成途徑,是陽春砂主要藥效物質(zhì)乙酸龍腦酯生物合成途徑的關(guān)鍵酶。AvPS參與陽春砂中α-蒎烯和β-蒎烯合成,根據(jù)AvPS的啟動子含有G-box推測其可能受MYC轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。另一方面,從陽春砂中克隆得到轉(zhuǎn)錄因子AvMYC2、AvMYC4b,并獲得了相應(yīng)的純化蛋白,為其后續(xù)的生物功能鑒定及AvPS的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

跡%hinalool）、月桂烯（myrcene）等揮發(fā)性萜類成分 (圖1B)。因此，陽春砂萜類生物合成途徑的研究有著重要的作用。目前，從化學(xué)角度比較了不同產(chǎn)地品種陽春砂揮發(fā)油化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)化學(xué)成分基本相似，但是含量存在差異，還對陽春砂進行化學(xué)質(zhì)量評價[6, 7]；并從雜交新種選育及其與母本的生長特性及形態(tài)特征和從陽春砂果實生長發(fā)育規(guī)律及其落果生理機制進行研究[8, 9]。通過中藥生物技術(shù)的方法對陽春砂萜類合成代謝途徑的研究也逐漸加深，已經(jīng)克隆并鑒定了陽春砂萜類上游生物合成途徑的兩個關(guān)鍵酶 HMGR 和 DXR 基因[10, 11]，并獲得了兩個陽春砂的轉(zhuǎn)錄組及多個表達譜，并初步篩選了部分萜類代謝途徑的相關(guān)萜類合酶基因，特別是下游途徑的萜類合酶基因[12]，，還篩選出了與萜類合成相關(guān)的若干個轉(zhuǎn)錄因子，包括 AvMYC2 與 AvMYC4b[13]。1.2 萜類合酶及其參與萜類生物合成途徑的研究進展萜類化合物是植物生產(chǎn)的無數(shù)種化合物中最多樣化的天然產(chǎn)物，植物中的萜類大部分為芳香物質(zhì)，并在傳統(tǒng)中草藥中發(fā)揮作用。在植物中，有兩種代謝途徑產(chǎn)生萜類化合物：細胞質(zhì)中的甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）途徑和細胞質(zhì)體中的 2-C-甲

vTPS1 擴大體積 PCR 產(chǎn)物；M1：DNA DL2000 marker；2：AvTPS3 擴大體積 PCR 產(chǎn)物；M2DL10 000 marker。圖 2 AvTPS1、AvTPS3 擴大體積 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果利用In-fusion的方法將AvTPS1、AvTPS3的純化產(chǎn)物連接到表達載體pET32a表達載體重組質(zhì)粒 pET32a-AvTPS1、pET32a-AvTPS3，經(jīng)過 PCR 篩選（圖
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S567.239;Q943.2

【參考文獻】

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本文編號：2676989