【摘要】：O-乙酰絲氨酸(硫醇)裂解酶(OASTL)是一類在硫元素同化代謝中具有重要作用的酶類,在半胱氨酸合成的最后一步起著關(guān)鍵的催化作用。近年來,植物中OASTL的功能逐漸被解析,除了半胱氨酸合成酶之外,它們還在硫代半胱氨酸的合成,硫化氫的生成以及去氰毒過程中起作用。目前在植物中,僅在擬南芥中有關(guān)于這一類酶的詳細(xì)報道,此外,在番茄和油菜等雙子葉植物中也有對個別OASTL家族成員的功能研究,但是在單子葉植物中幾乎未見對OASTL家族基因功能的報道。谷子是一種具有抗旱性、強(qiáng)適應(yīng)性以及高光效的谷類作物,被視為極具有潛力的單子葉模式植物。因此,本研究以晉谷21號(Setaria italica)為材料,通過分子生物學(xué),生物信息學(xué)和生理生化等技術(shù)方法對谷子OASTL家族三個蛋白的功能進(jìn)行多層次的研究分析,為更深入了解谷子OASTL家族其它蛋白以及單子葉植物OASTL蛋白的功能與作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。下面是本文的主要實驗結(jié)果:1.基因克隆和序列分析:通過PCR技術(shù)獲得三個谷子OASTL家族基因的編碼序列,并分別命名為Si-OASTL7、Si-OASTL9和Si-OASTL10。通過生物信息學(xué)的方法對三個基因進(jìn)行分析比較,結(jié)果顯示,Si-OASTL7、Si-OASTL9和Si-OASTL10的編碼區(qū)長度分別為807 bp、858bp和855 bp;編碼蛋白長度分別為268、285、284個氨基酸。通過序列同源比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)谷子具有OASTL蛋白家族成員的保守序列,但在進(jìn)化上,它們同擬南芥等雙子葉植物OASTL蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn),相反它們存在于一個特異于單子葉植物的OASTL蛋白亞支。2.谷子OASTL蛋白的體外表達(dá):用限制性內(nèi)切酶將載體pMD-18T-SiOASTL7、pMD-18T-SiOASTL9和pMD-18T-SiOASTL10酶切,并將產(chǎn)物重組到p-Cold表達(dá)載體,之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,得到重組載體p-Cold-SiOASTL7、p-Cold-SiOASTL9和p-Cold-SiOASTL10,進(jìn)一步通過菌液PCR和雙酶切鑒定證明重組載體構(gòu)建成功,然后將3個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)表達(dá)菌株BL21(DE3)中。將以上構(gòu)建好的三個表達(dá)載體用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo),確定最終的誘導(dǎo)條件為0.2 mmol/L的IPTG、16℃條件下過夜誘導(dǎo)。通過Ni柱親和層析純化得到Si-OASTL7、Si-OASTL9和Si-OASTL10的體外表達(dá)蛋白。雜蛋白與目的蛋白的最佳洗脫濃度分別是200mmol/L和500 mmol/L。3.蛋白酶活分析:對純化所得到的三個蛋白進(jìn)行酶活分析,實驗結(jié)果表明:在Si-OASTL7、Si-OASTL9和Si-OASTL10這三個蛋白中,只有Si-OASTL9同時具有催化半胱氨酸和硫代半胱氨酸合成的能力,而Si-OASTL7和Si-OASTL10在生成H_2S、半胱氨酸以及硫代半胱氨酸的過程中均沒有活性。4.三個基因的表達(dá)模式分析:通過qRT-PCR檢測了Si-OASTL7、Si-OASTL9和Si-OASTL10在谷子各個器官組織中的表達(dá)水平,以及高鹽、干旱和重金屬鎘(Cd)脅迫處理后三個基因的表達(dá)水平變化。結(jié)果顯示,在谷子的各個組織器官中三個基因均有表達(dá),其中葉片中表達(dá)水平最高;在干旱和高鹽的脅迫條件下,三個基因的表達(dá)量均有顯著的升高,并在處理9h時表達(dá)水平達(dá)到最高;但在Cd脅迫處理下,只有Si-OASTL9的表達(dá)水平顯著上調(diào),另外兩個基因沒有變化。綜上所述,本實驗通過生物信息學(xué)手段對谷子OASTL家族基因進(jìn)行了初步分析,完成了三個Si-OASTL基因的克隆與原核表達(dá)載體的構(gòu)建,并進(jìn)行了蛋白的體外表達(dá),純化與酶活分析;此外,還分析了這3個Si-OASTL基因在植株生長發(fā)育的不同組織和脅迫條件下表達(dá)水平的變化,為谷子中OASTL家族蛋白功能的進(jìn)一步分析奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

植物硫的吸收過程硫（Sulfur，S）作為大量元素之一，參與植物的生長過程，在植物干重中所 0.1%-1%[1, 2, 3]。在高等植物中硫的主要來源是植物從根部吸收硫酸鹽，另外可以吸收地上部分的氣體硫[4]。一般情況下，在植物中無機(jī)硫變?yōu)橛袡C(jī)硫的途過根部吸收的硫酸鹽還原反應(yīng)生成兩種重要的含硫氨基酸：蛋氨酸（Met）與酸（Cys）[5]。在植物的生長和適應(yīng)環(huán)境過程中也有其它的含硫化合物參與[6]物生長過程中，適度施加硫肥可以改善植物生長狀況和質(zhì)量[7]。因此，硫的含物生長和發(fā)育過程中起重要作用[8]。植物吸收硫?qū)儆谥鲃游盏倪^程，主要途徑是植物根部從土壤中吸收 SO42-，程在硫轉(zhuǎn)運(yùn)體（sulfate transporter ST）的協(xié)助下完成[9]。此外，半胱氨酸的合在線粒體中，同樣也在質(zhì)體和胞質(zhì)中合成。但是在硫同化途徑中硫還原部分在質(zhì)體中。從土壤中吸收 SO42-到合成 Cys 是一個較為復(fù)雜的過程，涉及到多下圖為形成半胱氨酸的具體機(jī)制：

多樣的家族蛋白，而谷子不僅僅4]，但是關(guān)于該家族基因在谷子了三個 OASTL 家族基因，，通過生物信息學(xué)的方法對 S質(zhì)，高級結(jié)構(gòu)以及同源性做了，源于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研后的幼苗。種子消毒方法：先用ClO 消毒 10 min 左右，之后用蒸上鋪四層紗布，最后將適量種子為 25℃，光照強(qiáng)度為 160 μE·苗生長 5 d 之后，每天需更換 1
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S515

【參考文獻(xiàn)】

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2 黃庶識;盧明倩;李冰;周冰;陳麗梅;;重組大腸桿菌表達(dá)可溶性蛋白和包涵體過程的拉曼光譜實時分析[J];中國激光;2014年12期

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本文編號：2676730