【摘要】：杏(Prunus armeniaca L.)是重要的薔薇科(Rosaceae)果樹(shù),其果實(shí)色澤艷麗、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富,在果品市場(chǎng)上頗受消費(fèi)者喜愛(ài)。新疆杏作為獨(dú)特的生態(tài)品種群,有白色、黃色、橙色和紅色等眾多變異類型,其底色主要受類胡蘿卜素積累的影響。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因(CCD)在杏果實(shí)呈色和特征香氣成分芳香味脫輔基類胡蘿卜素的形成中扮有重要作用,但其具體作用和機(jī)制尚不明確。本研究在前期轉(zhuǎn)錄組挖掘得到的兩個(gè)CCDs的基礎(chǔ)上,以不同色澤類型的新疆杏果實(shí)為材料,采用高效液相色譜(HPLC)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測(cè)分析果實(shí)成熟過(guò)程中類胡蘿卜素和芳香味脫輔基類胡蘿卜素的組成和含量變化,通過(guò)基因表達(dá)模式分析、基因克隆、亞細(xì)胞定位、生物信息學(xué)分析和啟動(dòng)子缺失等方法鑒定分析PaCCD1和PaCCD4在杏果實(shí)類胡蘿卜素代謝中的作用。主要研究結(jié)果包括:1.從供試品種的果實(shí)中共檢測(cè)出7種類胡蘿卜素,包括:β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)、α-胡蘿卜素、八氫番茄紅素、新黃質(zhì)、葉黃質(zhì)和紫黃質(zhì)。果實(shí)發(fā)育的完熟期(S5),深色品種(旦杏和紅玉杏)主要以積累β-胡蘿卜素為主,分別占果皮中類胡蘿卜素總量的64.09%和73.32%,同時(shí)還含有α-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)、葉黃質(zhì)、紫黃質(zhì)和少量的新黃質(zhì),其中,α-胡蘿卜素和β-隱黃質(zhì)為僅在2個(gè)深色品種中檢測(cè)到的物質(zhì)。淺色品種(輪臺(tái)小白杏和白杏)中的類胡蘿卜素含量顯著低于深色品種(P0.05),輪臺(tái)小白杏主要以積累葉黃質(zhì)為主,果皮中該物質(zhì)含量占類胡蘿卜素總含量的68.89%,白杏主要以積累葉黃質(zhì)和β-胡蘿卜素為主,分別占果皮類胡蘿卜素總量的38.94%和24.87%。果實(shí)發(fā)育過(guò)程中,深色品種中主要類胡蘿卜素迅速積累,淺色品種中β-胡蘿卜素的含量迅速降低,八氫番茄紅素的含量在果實(shí)成熟過(guò)程中增加。共檢測(cè)到β-大馬酮、β-紫羅蘭酮和二氫-β-紫羅蘭酮3種具有芳香味的脫輔基類胡蘿卜素,其中β-紫羅蘭酮的含量最為豐富。果實(shí)發(fā)育過(guò)程中,各品種的果實(shí)中芳香味脫輔基類胡蘿卜素的含量均顯著增加,但淺色品種中β-紫羅蘭酮的含量顯著高于其在深色品種中的含量(P0.05)。2.采用RACE技術(shù)從“輪臺(tái)小白杏”果實(shí)中分別克隆得到PaCCD1和PaCCD4基因的全長(zhǎng)序列,這兩個(gè)基因的ORF分別為1644bp和1812bp,各自編碼547和604個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)兩個(gè)蛋白的分子量分別為61.699和66.021KD,等電點(diǎn)分別為6.16和6.65。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,兩個(gè)基因均能與已知功能的相應(yīng)基因家族成員聚在一起,且與薔薇科果樹(shù)桃的同源性最高。蛋白結(jié)構(gòu)分析表明,二者均含有典型的RPE65結(jié)構(gòu)域,符合CCD家族成員的特點(diǎn)。并對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行了亞細(xì)胞定位觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PaCCD1定位于細(xì)胞質(zhì),PaCCD4定位于質(zhì)體。3.采用實(shí)時(shí)熒光定量(qPCR)技術(shù)對(duì)PaCCD1和PaCCD4的時(shí)空表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),PaCCD1和PaCCD4在果實(shí)中的表達(dá)最高,在花中也有表達(dá),在根、莖、葉中基本上不表達(dá),表明兩個(gè)CCDs為果實(shí)中特異表達(dá)的基因。整體上,PaCCD1在各個(gè)品種前四個(gè)發(fā)育階段表達(dá)量均上升,與果實(shí)中脫輔基類胡蘿卜素含量變化趨勢(shì)一致,表明PaCCD1可能參與裂解杏果實(shí)中類胡蘿卜素形成芳香味脫輔基類胡蘿卜素。PaCCD4基因在淺黃色品種中表達(dá)量高于紅橙色品種而使其果實(shí)顏色表現(xiàn)為淺黃色。紅橙色品種由于其表達(dá)量較小而使果實(shí)的底色黃色變深,表明PaCCD4可能參與調(diào)節(jié)杏果實(shí)中類胡蘿卜素的積累。而類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因中PDS、CRTISO和ZEP在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中對(duì)類胡蘿卜素的調(diào)控作用影響較小,PSY、LCYB和CHYB對(duì)果實(shí)中類胡蘿卜素的合成均有一定的調(diào)控作用。4.為了查找杏果實(shí)PaCCD1和PaCCD4基因的上游調(diào)控元件,本研究使用基因組步移法,分別克隆了PaCCD1和PaCCD4基因啟動(dòng)子區(qū)2233bp和1838bp的序列。順式作用元件分析發(fā)現(xiàn),兩個(gè)啟動(dòng)子均含有多個(gè)與光、脫落酸、茉莉酸甲酯等與環(huán)境因子、激素信號(hào)和調(diào)控組織表達(dá)的順式作用元件。此外,PaCCD1啟動(dòng)子中含有刺激誘導(dǎo)和熱脅迫響應(yīng)元件,PaCCD4啟動(dòng)子中含有赤霉素、低溫和增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄水平的元件,表明CCDs基因家族在植物體發(fā)育過(guò)程中能夠參與多種生命活動(dòng)。5.為了確定基因啟動(dòng)子的核心區(qū)域,使用啟動(dòng)子缺失實(shí)驗(yàn),構(gòu)建了5’端啟動(dòng)子缺失片段并瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行GUS活性檢測(cè),結(jié)果表明,隨啟動(dòng)子片段的缺失,PaCCD1和PaCCD4的GUS活性逐漸減弱,PaCCD1的啟動(dòng)子核心區(qū)域在600bp—2233bp區(qū)段內(nèi),PaCCD4的啟動(dòng)子核心區(qū)域在600bp—1838bp區(qū)段內(nèi),為進(jìn)一步篩選轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-1 植物類胡蘿卜素的生物合成途徑[67]Fig.1-1 Biosynthesis pathway of plant carotenoid蘿卜素的裂解解雙加氧酶（CCDs）是分解類胡蘿卜素多烯鏈的形成脫輔基類胡蘿卜素的關(guān)鍵酶。其共同特點(diǎn)是而，除了四個(gè)嚴(yán)格保守的組氨酸殘基參與鐵與氧氨酸也固定在組氨酸的位置上，類胡蘿卜素裂解酸序列是相似的[68]。CCDs 包括類胡蘿卜素裂解雙胡蘿卜素雙氧合酶（9- cis - Epoxy carotenoid d中類胡蘿卜素裂解酶根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育和基因功能被1, CCD4, CCD7 和 CCD8[69,70]，各個(gè)亞家族的功能要通過(guò)廣泛的裂解位置和底物特異性來(lái)產(chǎn)生植物激多種脫輔基類胡蘿卜素，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。CCD 基因已在多種植物中報(bào)道，擬南芥中包含 CC中有 5 個(gè) 9-順式雙加氧酶，分別是 AtNCE

圖 1-2 CCD 和 NCEDs 的裂解產(chǎn)物脫輔基類胡蘿卜素Fig.1-2 The cleavage products of CCD and NCEDs apocarotenoidsNCED 與其它 4 個(gè)亞家族成員的同源性很低，，其底物特異性和功能也明NCED 在 11,12 雙鍵位上通過(guò)不對(duì)稱裂解新黃質(zhì)或紫黃質(zhì)產(chǎn)生 C15 的產(chǎn)物它能夠參與植物激素脫落酸合成的限速步驟[74-76]。NCED 作為 ABA 生物關(guān)鍵酶，已在多種植物中被證明其表達(dá)與果實(shí)發(fā)育和成熟密切相關(guān)[77]。Perseaamericana）PaNCED1 和 PaNCED3 能調(diào)控果實(shí)的成熟[78]；在olanumlycopersicum）中特異性抑制 SlNCED1 基因能延緩果實(shí)成熟并延長(zhǎng)9]；此外，用煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)莓（Fragaria × ananassa）FaNCED1 基因下調(diào)會(huì)導(dǎo)致 ABA 含量顯著降低[A 在植物的果實(shí)發(fā)育和成熟過(guò)程中也起著重要作用，尤其是對(duì)非躍變型果實(shí)內(nèi)源 ABA 合成來(lái)延緩葡萄成熟[82]，而外源 ABA 對(duì)葡萄漿果的著色有促3]。擬南芥中的 5 個(gè) NCED 成員均定位于細(xì)胞質(zhì)中。擬南芥 NCED3 突變脅迫后不能積累 ABA，而 NCED 基因的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致 ABA 積累和耐旱
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S662.2

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本文編號(hào)：2676676