【摘要】：杏(Prunus armeniaca L.)是重要的薔薇科(Rosaceae)果樹,其果實色澤艷麗、風味獨特、營養(yǎng)豐富,在果品市場上頗受消費者喜愛。新疆杏作為獨特的生態(tài)品種群,有白色、黃色、橙色和紅色等眾多變異類型,其底色主要受類胡蘿卜素積累的影響。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因(CCD)在杏果實呈色和特征香氣成分芳香味脫輔基類胡蘿卜素的形成中扮有重要作用,但其具體作用和機制尚不明確。本研究在前期轉(zhuǎn)錄組挖掘得到的兩個CCDs的基礎上,以不同色澤類型的新疆杏果實為材料,采用高效液相色譜(HPLC)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測分析果實成熟過程中類胡蘿卜素和芳香味脫輔基類胡蘿卜素的組成和含量變化,通過基因表達模式分析、基因克隆、亞細胞定位、生物信息學分析和啟動子缺失等方法鑒定分析PaCCD1和PaCCD4在杏果實類胡蘿卜素代謝中的作用。主要研究結(jié)果包括:1.從供試品種的果實中共檢測出7種類胡蘿卜素,包括:β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)、α-胡蘿卜素、八氫番茄紅素、新黃質(zhì)、葉黃質(zhì)和紫黃質(zhì)。果實發(fā)育的完熟期(S5),深色品種(旦杏和紅玉杏)主要以積累β-胡蘿卜素為主,分別占果皮中類胡蘿卜素總量的64.09%和73.32%,同時還含有α-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)、葉黃質(zhì)、紫黃質(zhì)和少量的新黃質(zhì),其中,α-胡蘿卜素和β-隱黃質(zhì)為僅在2個深色品種中檢測到的物質(zhì)。淺色品種(輪臺小白杏和白杏)中的類胡蘿卜素含量顯著低于深色品種(P0.05),輪臺小白杏主要以積累葉黃質(zhì)為主,果皮中該物質(zhì)含量占類胡蘿卜素總含量的68.89%,白杏主要以積累葉黃質(zhì)和β-胡蘿卜素為主,分別占果皮類胡蘿卜素總量的38.94%和24.87%。果實發(fā)育過程中,深色品種中主要類胡蘿卜素迅速積累,淺色品種中β-胡蘿卜素的含量迅速降低,八氫番茄紅素的含量在果實成熟過程中增加。共檢測到β-大馬酮、β-紫羅蘭酮和二氫-β-紫羅蘭酮3種具有芳香味的脫輔基類胡蘿卜素,其中β-紫羅蘭酮的含量最為豐富。果實發(fā)育過程中,各品種的果實中芳香味脫輔基類胡蘿卜素的含量均顯著增加,但淺色品種中β-紫羅蘭酮的含量顯著高于其在深色品種中的含量(P0.05)。2.采用RACE技術(shù)從“輪臺小白杏”果實中分別克隆得到PaCCD1和PaCCD4基因的全長序列,這兩個基因的ORF分別為1644bp和1812bp,各自編碼547和604個氨基酸,預測兩個蛋白的分子量分別為61.699和66.021KD,等電點分別為6.16和6.65。系統(tǒng)進化分析表明,兩個基因均能與已知功能的相應基因家族成員聚在一起,且與薔薇科果樹桃的同源性最高。蛋白結(jié)構(gòu)分析表明,二者均含有典型的RPE65結(jié)構(gòu)域,符合CCD家族成員的特點。并對兩個基因進行了亞細胞定位觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PaCCD1定位于細胞質(zhì),PaCCD4定位于質(zhì)體。3.采用實時熒光定量(qPCR)技術(shù)對PaCCD1和PaCCD4的時空表達模式分析發(fā)現(xiàn),PaCCD1和PaCCD4在果實中的表達最高,在花中也有表達,在根、莖、葉中基本上不表達,表明兩個CCDs為果實中特異表達的基因。整體上,PaCCD1在各個品種前四個發(fā)育階段表達量均上升,與果實中脫輔基類胡蘿卜素含量變化趨勢一致,表明PaCCD1可能參與裂解杏果實中類胡蘿卜素形成芳香味脫輔基類胡蘿卜素。PaCCD4基因在淺黃色品種中表達量高于紅橙色品種而使其果實顏色表現(xiàn)為淺黃色。紅橙色品種由于其表達量較小而使果實的底色黃色變深,表明PaCCD4可能參與調(diào)節(jié)杏果實中類胡蘿卜素的積累。而類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因中PDS、CRTISO和ZEP在果實發(fā)育過程中對類胡蘿卜素的調(diào)控作用影響較小,PSY、LCYB和CHYB對果實中類胡蘿卜素的合成均有一定的調(diào)控作用。4.為了查找杏果實PaCCD1和PaCCD4基因的上游調(diào)控元件,本研究使用基因組步移法,分別克隆了PaCCD1和PaCCD4基因啟動子區(qū)2233bp和1838bp的序列。順式作用元件分析發(fā)現(xiàn),兩個啟動子均含有多個與光、脫落酸、茉莉酸甲酯等與環(huán)境因子、激素信號和調(diào)控組織表達的順式作用元件。此外,PaCCD1啟動子中含有刺激誘導和熱脅迫響應元件,PaCCD4啟動子中含有赤霉素、低溫和增強轉(zhuǎn)錄水平的元件,表明CCDs基因家族在植物體發(fā)育過程中能夠參與多種生命活動。5.為了確定基因啟動子的核心區(qū)域,使用啟動子缺失實驗,構(gòu)建了5’端啟動子缺失片段并瞬時轉(zhuǎn)化煙草進行GUS活性檢測,結(jié)果表明,隨啟動子片段的缺失,PaCCD1和PaCCD4的GUS活性逐漸減弱,PaCCD1的啟動子核心區(qū)域在600bp—2233bp區(qū)段內(nèi),PaCCD4的啟動子核心區(qū)域在600bp—1838bp區(qū)段內(nèi),為進一步篩選轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子奠定了基礎。
【圖文】：

圖 1-1 植物類胡蘿卜素的生物合成途徑[67]Fig.1-1 Biosynthesis pathway of plant carotenoid蘿卜素的裂解解雙加氧酶（CCDs）是分解類胡蘿卜素多烯鏈的形成脫輔基類胡蘿卜素的關(guān)鍵酶。其共同特點是而，除了四個嚴格保守的組氨酸殘基參與鐵與氧氨酸也固定在組氨酸的位置上，類胡蘿卜素裂解酸序列是相似的[68]。CCDs 包括類胡蘿卜素裂解雙胡蘿卜素雙氧合酶（9- cis - Epoxy carotenoid d中類胡蘿卜素裂解酶根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育和基因功能被1, CCD4, CCD7 和 CCD8[69,70]，各個亞家族的功能要通過廣泛的裂解位置和底物特異性來產(chǎn)生植物激多種脫輔基類胡蘿卜素，從而發(fā)揮其生物學功能。CCD 基因已在多種植物中報道，擬南芥中包含 CC中有 5 個 9-順式雙加氧酶，分別是 AtNCE

圖 1-2 CCD 和 NCEDs 的裂解產(chǎn)物脫輔基類胡蘿卜素Fig.1-2 The cleavage products of CCD and NCEDs apocarotenoidsNCED 與其它 4 個亞家族成員的同源性很低，，其底物特異性和功能也明NCED 在 11,12 雙鍵位上通過不對稱裂解新黃質(zhì)或紫黃質(zhì)產(chǎn)生 C15 的產(chǎn)物它能夠參與植物激素脫落酸合成的限速步驟[74-76]。NCED 作為 ABA 生物關(guān)鍵酶，已在多種植物中被證明其表達與果實發(fā)育和成熟密切相關(guān)[77]。Perseaamericana）PaNCED1 和 PaNCED3 能調(diào)控果實的成熟[78]；在olanumlycopersicum）中特異性抑制 SlNCED1 基因能延緩果實成熟并延長9]；此外，用煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）誘導基因沉默技術(shù)莓（Fragaria × ananassa）FaNCED1 基因下調(diào)會導致 ABA 含量顯著降低[A 在植物的果實發(fā)育和成熟過程中也起著重要作用，尤其是對非躍變型果實內(nèi)源 ABA 合成來延緩葡萄成熟[82]，而外源 ABA 對葡萄漿果的著色有促3]。擬南芥中的 5 個 NCED 成員均定位于細胞質(zhì)中。擬南芥 NCED3 突變脅迫后不能積累 ABA，而 NCED 基因的過表達會導致 ABA 積累和耐旱
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S662.2

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本文編號：2676676