【摘要】：研究背景有汗性外胚葉發(fā)育不良(hidrotic ectodermaldysplasia,HED),也被稱(chēng)為Clouston綜合征,是一種常染色體顯性遺傳的以掌跖角化過(guò)度、甲營(yíng)養(yǎng)不良以及毛發(fā)缺陷等三聯(lián)征為特征的遺傳性綜合征。有汗性外胚葉發(fā)育不良的致病基因?yàn)榫幋a縫隙連接蛋白30(Cx30)的GJB6基因。至今共發(fā)現(xiàn)五種錯(cuò)義突變,分別為G11R、A88V、V37E、D50N和N14S。迄今為止對(duì)有汗性外胚葉發(fā)育不良這個(gè)疾病的發(fā)病機(jī)制研究比較少,對(duì)致病的GJB6基因進(jìn)行更加深入的探究是很有必要的,希望能取得更進(jìn)一步的進(jìn)展。首先運(yùn)用Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了 GJB6基因野生型及其突變型A88V的HaCaT細(xì)胞的穩(wěn)定株是本課題組的前期工作,接下來(lái)進(jìn)一步運(yùn)用構(gòu)建的G11R突變(功能最強(qiáng))的HaCaT細(xì)胞的穩(wěn)定株制作出Affymetrix表達(dá)譜芯片,研究了GJB6基因可能參與的信號(hào)通路及其可能的作用機(jī)制,并且通過(guò)細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步了解了GJB6基因突變引起HaCaT細(xì)胞凋亡的機(jī)制,對(duì)GJB6基因突變體引起有汗性外胚葉發(fā)育不良復(fù)雜多樣的臨床表型的可能作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。本研究中,仍然運(yùn)用以Tet-on慢病毒轉(zhuǎn)染為載體建立的GJB6基因及其三種突變體(D50N、V37E、A88V)的HaCaT細(xì)胞的穩(wěn)定株,通過(guò)四種細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn),在不同突變體之間進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)對(duì)比。目的通過(guò)對(duì)運(yùn)用Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建的GJB6三種突變型(D50N、V37E、A88V)及其野生型的HaCaT細(xì)胞的穩(wěn)定株進(jìn)行四種細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn),并且分組比較這些不同的突變體對(duì)于細(xì)胞增殖、凋亡和衰老功能的影響,更加進(jìn)一步地對(duì)GJB6基因突變體引起有汗性外胚葉發(fā)育不良不同臨床表型的可能機(jī)制進(jìn)行探究,以便為后續(xù)對(duì)有汗性外胚葉發(fā)育不良進(jìn)行分型研究提供細(xì)胞功能學(xué)研究基礎(chǔ)。方法本實(shí)驗(yàn)使用已成功構(gòu)建的GJB6基因突變型(D50N、V37E、A88V)和野生型的穩(wěn)定細(xì)胞株,運(yùn)用MTT法和Brdu法檢測(cè)GJB6基因突變型和野生型經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)目的基因表達(dá)后對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖功能方面的影響;用Caspase3/7酶活性法檢測(cè)GJB6基因突變型和野生型經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)目的基因表達(dá)后對(duì)HaCaT細(xì)胞凋亡功能方面的影響;用SA-β-gal染色法檢測(cè)GJB6基因突變型和野生型經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)目的基因表達(dá)后對(duì)HaCaT細(xì)胞衰老功能方面的影響。結(jié)果MTT法檢測(cè)結(jié)果:D50N+DOX組細(xì)胞增殖抑制率最高,其次為A88V+DOX組,V37E+DOX組細(xì)胞增殖抑制率最低。Brdu法檢測(cè)結(jié)果:D50N+DOX組細(xì)胞增殖抑制率最高,其次為A88V+DOX組,V37E+DOX組細(xì)胞增殖抑制率最低。Caspase3/7酶活性法結(jié)果:D50N+DOX組HaCaT細(xì)胞凋亡增加,而A88V+DOX組和V37E+DOX組比起WT+DOX組(對(duì)照組)和NC+DOX組(空白組)HaCaT細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡減少的表現(xiàn)。SA-β-gal染色法檢測(cè)結(jié)果:各組中,衰老細(xì)胞數(shù)量均較少(有些視野未出現(xiàn)衰老細(xì)胞),即各組細(xì)胞均未發(fā)生明顯衰老。結(jié)論我在前期工作中查閱的文獻(xiàn)中報(bào)道的人GJB6基因突變型D50N的病例可以說(shuō)是鳳毛麟角,但相較于突變型A88V和V37E具有更大的研究?jī)r(jià)值。因?yàn)镈50N突變體在細(xì)胞功能學(xué)上的特殊性,提示此突變型是否與有汗性外胚葉發(fā)育不良的癥狀的復(fù)雜性及某些呈現(xiàn)負(fù)向的癥狀具有一定的相關(guān)性,如大部分患者甲板增厚,而極少數(shù)患者指甲表現(xiàn)薄而脆并縮短。上述推測(cè)是否成立需要實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建相關(guān)的動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證。
【圖文】：

０．０００邋…逡逑ｄａｙ邋３逡逑圖２ｆ經(jīng)過(guò)四環(huán)素處理的五組ＯＤ４５０／ｆ0ｌｄ的均值繪制出柱狀圖。更清晰的觀察到Ｄ５０Ｎ＋ＤＯＸ逡逑組細(xì)胞增殖呈現(xiàn)嚴(yán)重抑制，細(xì)胞增殖率甚至已經(jīng)低于空白組（ＮＣ＋ＤＯＸ）。逡逑３３逡逑

ｄａｙ邋１邐ｄａｙ邋３逡逑圖２ｅ經(jīng)過(guò)四環(huán)素處理的五組的第一天和第三天的ＯＤ４５０值繪制出柱狀圖。逡逑１．４００逡逑■ＮＣ＋ＤＯＸ逡逑１．２００邋｜邋邐逡逑邐邋■邋ＷＴ＋ＤＯＸ逡逑１．０００邋Ｔ逡逑０．８００逡逑＿邋Ａ８８Ｖ＋ＤＯＸ逡逑＿Ｖ３７Ｅ＋ＤＯＸ逡逑０．４００逡逑０．２００逡逑０．０００邋…逡逑ｄａｙ邋３逡逑圖２ｆ經(jīng)過(guò)四環(huán)素處理的五組ＯＤ４５０／ｆ0ｌｄ的均值繪制出柱狀圖。更清晰的觀察到Ｄ５０Ｎ＋ＤＯＸ逡逑組細(xì)胞增殖呈現(xiàn)嚴(yán)重抑制，，細(xì)胞增殖率甚至已經(jīng)低于空白組（ＮＣ＋ＤＯＸ）。逡逑３３逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R758.5

【參考文獻(xiàn)】

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8 陳曉霞;蒲曉英;代U

本文編號(hào)：2676619