【摘要】：研究背景有汗性外胚葉發(fā)育不良(hidrotic ectodermaldysplasia,HED),也被稱為Clouston綜合征,是一種常染色體顯性遺傳的以掌跖角化過度、甲營養(yǎng)不良以及毛發(fā)缺陷等三聯(lián)征為特征的遺傳性綜合征。有汗性外胚葉發(fā)育不良的致病基因為編碼縫隙連接蛋白30(Cx30)的GJB6基因。至今共發(fā)現(xiàn)五種錯義突變,分別為G11R、A88V、V37E、D50N和N14S。迄今為止對有汗性外胚葉發(fā)育不良這個疾病的發(fā)病機制研究比較少,對致病的GJB6基因進行更加深入的探究是很有必要的,希望能取得更進一步的進展。首先運用Tet-on基因表達系統(tǒng)成功構(gòu)建了 GJB6基因野生型及其突變型A88V的HaCaT細胞的穩(wěn)定株是本課題組的前期工作,接下來進一步運用構(gòu)建的G11R突變(功能最強)的HaCaT細胞的穩(wěn)定株制作出Affymetrix表達譜芯片,研究了GJB6基因可能參與的信號通路及其可能的作用機制,并且通過細胞功能學(xué)實驗進一步了解了GJB6基因突變引起HaCaT細胞凋亡的機制,對GJB6基因突變體引起有汗性外胚葉發(fā)育不良復(fù)雜多樣的臨床表型的可能作用機制進行了初步探討。本研究中,仍然運用以Tet-on慢病毒轉(zhuǎn)染為載體建立的GJB6基因及其三種突變體(D50N、V37E、A88V)的HaCaT細胞的穩(wěn)定株,通過四種細胞功能學(xué)實驗,在不同突變體之間進行細胞功能學(xué)對比。目的通過對運用Tet-on基因表達系統(tǒng)成功構(gòu)建的GJB6三種突變型(D50N、V37E、A88V)及其野生型的HaCaT細胞的穩(wěn)定株進行四種細胞功能學(xué)實驗,并且分組比較這些不同的突變體對于細胞增殖、凋亡和衰老功能的影響,更加進一步地對GJB6基因突變體引起有汗性外胚葉發(fā)育不良不同臨床表型的可能機制進行探究,以便為后續(xù)對有汗性外胚葉發(fā)育不良進行分型研究提供細胞功能學(xué)研究基礎(chǔ)。方法本實驗使用已成功構(gòu)建的GJB6基因突變型(D50N、V37E、A88V)和野生型的穩(wěn)定細胞株,運用MTT法和Brdu法檢測GJB6基因突變型和野生型經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)目的基因表達后對HaCaT細胞增殖功能方面的影響;用Caspase3/7酶活性法檢測GJB6基因突變型和野生型經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)目的基因表達后對HaCaT細胞凋亡功能方面的影響;用SA-β-gal染色法檢測GJB6基因突變型和野生型經(jīng)四環(huán)素誘導(dǎo)目的基因表達后對HaCaT細胞衰老功能方面的影響。結(jié)果MTT法檢測結(jié)果:D50N+DOX組細胞增殖抑制率最高,其次為A88V+DOX組,V37E+DOX組細胞增殖抑制率最低。Brdu法檢測結(jié)果:D50N+DOX組細胞增殖抑制率最高,其次為A88V+DOX組,V37E+DOX組細胞增殖抑制率最低。Caspase3/7酶活性法結(jié)果:D50N+DOX組HaCaT細胞凋亡增加,而A88V+DOX組和V37E+DOX組比起WT+DOX組(對照組)和NC+DOX組(空白組)HaCaT細胞呈現(xiàn)凋亡減少的表現(xiàn)。SA-β-gal染色法檢測結(jié)果:各組中,衰老細胞數(shù)量均較少(有些視野未出現(xiàn)衰老細胞),即各組細胞均未發(fā)生明顯衰老。結(jié)論我在前期工作中查閱的文獻中報道的人GJB6基因突變型D50N的病例可以說是鳳毛麟角,但相較于突變型A88V和V37E具有更大的研究價值。因為D50N突變體在細胞功能學(xué)上的特殊性,提示此突變型是否與有汗性外胚葉發(fā)育不良的癥狀的復(fù)雜性及某些呈現(xiàn)負向的癥狀具有一定的相關(guān)性,如大部分患者甲板增厚,而極少數(shù)患者指甲表現(xiàn)薄而脆并縮短。上述推測是否成立需要實驗室構(gòu)建相關(guān)的動物模型進一步驗證。
【圖文】：

０．０００邋…逡逑ｄａｙ邋３逡逑圖２ｆ經(jīng)過四環(huán)素處理的五組ＯＤ４５０／ｆ0ｌｄ的均值繪制出柱狀圖。更清晰的觀察到Ｄ５０Ｎ＋ＤＯＸ逡逑組細胞增殖呈現(xiàn)嚴重抑制，細胞增殖率甚至已經(jīng)低于空白組（ＮＣ＋ＤＯＸ）。逡逑３３逡逑

ｄａｙ邋１邐ｄａｙ邋３逡逑圖２ｅ經(jīng)過四環(huán)素處理的五組的第一天和第三天的ＯＤ４５０值繪制出柱狀圖。逡逑１．４００逡逑■ＮＣ＋ＤＯＸ逡逑１．２００邋｜邋邐逡逑邐邋■邋ＷＴ＋ＤＯＸ逡逑１．０００邋Ｔ逡逑０．８００逡逑＿邋Ａ８８Ｖ＋ＤＯＸ逡逑＿Ｖ３７Ｅ＋ＤＯＸ逡逑０．４００逡逑０．２００逡逑０．０００邋…逡逑ｄａｙ邋３逡逑圖２ｆ經(jīng)過四環(huán)素處理的五組ＯＤ４５０／ｆ0ｌｄ的均值繪制出柱狀圖。更清晰的觀察到Ｄ５０Ｎ＋ＤＯＸ逡逑組細胞增殖呈現(xiàn)嚴重抑制，，細胞增殖率甚至已經(jīng)低于空白組（ＮＣ＋ＤＯＸ）。逡逑３３逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R758.5

【參考文獻】

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本文編號：2676619