【摘要】：多藥物及有毒化合物外排轉(zhuǎn)運家族(Multidrug And Toxic Compound Extrusion Family,MATE)蛋白是五類外排轉(zhuǎn)運家族蛋白之一,在各種生物體中起著重要作用。近年來,模式植物擬南芥中MATE家族蛋白研究也逐漸增多,但目前尚無小麥中該類蛋白研究的報道。本研究以一個小麥MATE家族轉(zhuǎn)運蛋白AK336065為研究對象,通過生物信息學、分子生物學、遺傳學、細胞生物學等方法對其進行克隆和功能研究。獲得以下實驗結果:(1)構建小麥、人、酵母、擬南芥MATE家族轉(zhuǎn)運蛋白的系統(tǒng)進化樹,發(fā)現(xiàn)它們之間具有較高的同源性。(2)通過將AK336065蛋白與已報道的古細菌PfMATE蛋白進行同源性序列比對,結果顯示二者具有較高同源性。根據(jù)PfMATE蛋白12個跨膜域的位置,預測了AK336065蛋白的12個跨膜域。通過蛋白亞細胞定位實驗,發(fā)現(xiàn)AK336065蛋白與晚期內(nèi)體的定位蛋白ARA7有大部分信號重合,表明AK336065蛋白主要定位于晚期內(nèi)體,推測AK336065蛋白可能參與細胞內(nèi)體介導的生物學過程。(3)通過構建二元載體,并通過農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化,獲得AK336065過表達轉(zhuǎn)基因植株系。AK336065基因過表達導致野生型擬南芥開花時間提前、葉片衰老加劇、蓮座葉矮化叢生等。在碳饑餓誘導植物衰老體系實驗中發(fā)現(xiàn),AK336065基因促進植物葉片衰老,表明AK336065基因參與了葉片衰老調(diào)控,是衰老的正調(diào)控因子。(4)發(fā)現(xiàn)AK336065過表達轉(zhuǎn)基因植株表型與實驗室研究的abs3-1D突變體表型較一致,而且根據(jù)進化分析,AK336065與ABS3、ABS4、ABS3L1、ABS3L2屬同一進化分支,猜測它們彼此的功能具有相似性。通過將AK336065基因在mateq突變體中過表達,發(fā)現(xiàn)其可以將mateq突變體表型回復至類似于abs3-1D突變體表型。表明AK336065與ABS3及其同源基因功能相似。(5)小麥AK336065蛋白可能作為一種自噬受體與小麥ATG8自噬家族蛋白具有保守的特異性相互作用。構建BiFC載體通過原生質(zhì)體表達,發(fā)現(xiàn)AK336065蛋白與TaATG8d蛋白存在物理互作。通過預測AK336065蛋白AIM區(qū)、丙氨酸取代實驗及雙分子熒光互補實驗來驗證這兩個蛋白互作發(fā)生的特異性。實驗發(fā)現(xiàn)將AK336065蛋白中預測的兩個AIM1、AIM2定點突變后,AK336065~(AIM1+AIM2)與TaATG8d蛋白互作受到明顯抑制。表明AK336065蛋白的AIM1、AIM2在與TaATG8d蛋白特異性互作中起重要作用。
【圖文】：

圖 2-1AK336065 與人、酵母、擬南芥 MATE 蛋白家族進化樹ig 2-1 Phylogenetic tree of AK336065 and Human, Yeast, and Arabidopsis MAtransporter family6065 在人、酵母、擬南芥 MATE 家族蛋白中的進化位置；藍框為酵母 YD、小麥 MATE 家族蛋白中的進化位置；綠框為人 hMATE1、hMATE2 在酵小麥 MATE 家族蛋白中的進化位置，比例尺代表氨基酸替換率me circle was the phylogenetic position of AK336065 in the human, yeast andin family; The blue frame circle was the phylogenetic position of yeast YDR33, Arabidopsis and wheat MATE protein family; The green frame circle was the uman hMATE1、hMATE2 in the yeast, Arabidopsis and wheat MATE protein scale showed amino acid replacement rates. MATE 蛋白同源性比對列比對軟件，輸出結果相同區(qū)域和相似區(qū)域分別用黑色和灰色陰對結果可以看出 AK336065 與 PfMATE 相似度較高，并根白的 12 個跨膜結構域來推測 AK336065 的可能跨膜結構域（圖

圖 2-2AK336065 與 PfMATE 蛋白同源性比對及跨膜結構域預測Fig 2-2 Homologous alignment result of AK336065 with PfMATE protein and theresult of transmembrane domains prediction.2 小麥 MATE 蛋白的亞細胞定位將 P35S::AK336065-GFP 融 合 表 達 載 體 與 晚 期 內(nèi) 體 定 位 融 合 載5S::mScarlet-ARA7 共同轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。結果顯示：AK336065-GFP 呈現(xiàn)離散的點信號（圖 2-3）；AK336065-GFP 與 mScarlet-ARA7 有大部分信號重合（圖 2-3）。蛋白定位于細胞的晚期內(nèi)體，可能參與了細胞內(nèi)體循環(huán)系統(tǒng)運輸過程。圖 2-3AK336065 在擬南芥葉肉細胞中的亞細胞定位Fig 2-3 Subcellular localization of AK336065 in Arabidopsis mesophyll cells
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2

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本文編號：2676510