【摘要】：保加利亞乳桿菌是乳酸菌發(fā)酵劑主體菌株,其在高密度培養(yǎng)過程中會(huì)受到由于流加堿法抑制酸而產(chǎn)生的鹽脅迫。前期研究表明外源添加甜菜堿可有效地緩解菌體所受到的脅迫壓力,但是這種方法不能使菌體恢復(fù)正常狀態(tài),分析其主要原因是在鹽脅迫條件下,菌體分裂增殖受到影響。目前,以保加利亞乳桿菌應(yīng)答鹽脅迫引起自身分裂增殖受到影響為切入點(diǎn)的研究很少,因此本課題以保加利亞乳桿菌為研究對(duì)象,分析鹽脅迫響應(yīng)基因的差異表達(dá)水平并構(gòu)建突變株,進(jìn)一步分析相關(guān)基因在菌體分裂增殖過程中起到的作用,為保加利亞乳桿菌分裂增殖機(jī)理的深入研究奠定一定的理論基礎(chǔ)。本文采用熒光定量PCR手段對(duì)信號(hào)響應(yīng)因子和膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等可能對(duì)鹽脅迫產(chǎn)生應(yīng)答的基因進(jìn)行了相對(duì)mRNA表達(dá)量分析。研究發(fā)現(xiàn),在鹽脅迫條件下,來自L.bulgaricus 34.5的6個(gè)信號(hào)響應(yīng)因子rr1-rr6基因的表達(dá)量均有提高,外源添加甜菜堿使這些基因的表達(dá)水平下調(diào)。分析5個(gè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn),L.bulgaricus34.5主要通過調(diào)控初級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的表達(dá)來響應(yīng)鹽脅迫壓力。其中,膜轉(zhuǎn)運(yùn)體基因feoA在鹽脅迫條件下表達(dá)量上調(diào)了3.59倍,添加甜菜堿后,表達(dá)量仍上調(diào)了2.65倍。為研究feoA基因?qū)Ρ＜永麃喨闂U菌分裂增殖的影響,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了基因敲除表達(dá)載體p UC19-F-t,利用同源重組技術(shù),以tet基因?yàn)榭剐院Y選標(biāo)記,敲除L.bulgaricus 34.5的feoA基因,并從生長(zhǎng)曲線、菌體形態(tài)變化和分裂相關(guān)基因的差異表達(dá)水平等多個(gè)方面對(duì)feoA基因與菌體生長(zhǎng)、分裂增殖的關(guān)系進(jìn)行了初步探討。研究發(fā)現(xiàn),基因feoA的缺失導(dǎo)致L.bulgaricus 34.5的遲滯期被延長(zhǎng)了1.5 h,菌體的生物量在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)后期下降了15%,穩(wěn)定期時(shí),恢復(fù)到野生株的同期水平。顯微觀察發(fā)現(xiàn),突變體△feoA菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期呈現(xiàn)出不規(guī)則的彎曲或半圓形的菌體形態(tài),穩(wěn)定期則呈現(xiàn)典型的乳酸菌的密集短桿狀形態(tài)。通過比較分裂相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),L.bulgaricus 34.5野生型菌株在對(duì)數(shù)期會(huì)顯著地提高基因ftsZ、mbl和mreB的表達(dá)水平以適應(yīng)菌體的高速分裂增殖狀態(tài)。基因feoA的缺失使ftsZ和mreB的表達(dá)與野生型相比產(chǎn)生一定的差異,在分裂趨于緩慢的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)后期,這兩種基因的表達(dá)量分別下降了0.61倍和0.31倍。推斷基因feoA的缺失能夠通過影響ftsZ和mreB的表達(dá)而影響菌體自身的分裂增殖,這種影響體現(xiàn)在突變體△feoA菌株在對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)量下降,形態(tài)異變,但是穩(wěn)定期的菌體不再受到明顯影響。
【圖文】：

哈爾濱工業(yè)大學(xué)工學(xué)碩士學(xué)位論文bulgaricus 34.5 菌體的生長(zhǎng)造成了一定的影響；其次，對(duì)菌株的表型進(jìn)行顯微觀察，通過對(duì)比野生型與突變型的形態(tài)來判斷目的基因的缺失是否對(duì)菌體形態(tài)有影響，使分裂受阻；最后，采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法檢測(cè)分裂相關(guān)基因 ftsZ、mreB 和mbl 的表達(dá)水平，分析目的基因的缺失是否在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)分裂關(guān)鍵基因的表達(dá)產(chǎn)生了影響，從而影響到菌株進(jìn)一步的分裂增殖。1.6 技術(shù)路線本課題技術(shù)路線如下圖 1-1 所示。

本研究所使用的菌株是分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的德式乳桿菌保加利亞亞種 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 34.5，前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)這是一株鹽敏感菌株，其亞致死鹽濃度為 0.2 mol/L NaCl，最佳外源甜菜堿（GB）添加濃度為1.2 mmol/L GB。2.1.3.2 大腸桿菌本研究中用于 DNA 克隆的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞是 Escherichia Coli DH 5α，購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。2.1.3.3 質(zhì)粒（1）本研究使用的抗性基因由質(zhì)粒 pBR322 提供。pBR322 質(zhì)粒具有四環(huán)素抗性，通過 PCR 擴(kuò)增獲得該質(zhì)粒上的四環(huán)素抗性基因。購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。（2）本研究所使用的敲除質(zhì)粒是 pUC19，該質(zhì)粒為氨芐青霉素抗性，長(zhǎng)度為2686 bp，具有編碼 lacZ 蛋白氨基末端的部分序列，在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 E. ColiDH 5α 中可以表現(xiàn)出 α-互補(bǔ)現(xiàn)象，，從而通過藍(lán)白斑篩選，獲得重組克隆子。購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TS201.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 姚遠(yuǎn);喬佳鑫;李靜;李慧;莫日根;;大腸桿菌TorS/TorR二組分體應(yīng)答蛋白TorR對(duì)DNA復(fù)制起始的影響[J];遺傳;2015年03期

2 高薇;韓雪;張?zhí)m威;;乳酸菌滲透脅迫相關(guān)相容性溶質(zhì)及其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)通報(bào);2013年11期

3 陳衛(wèi);趙山山;張秋香;;乳酸菌的耐鹽機(jī)制[J];中國(guó)食品學(xué)報(bào);2013年10期

4 桑昱;陶晶;姚玉峰;;細(xì)菌分裂Z環(huán)定位的調(diào)控方式[J];微生物學(xué)報(bào);2013年04期

5 康涵;吳文娟;;絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶在結(jié)核分枝桿菌致病機(jī)制中的作用[J];微生物與感染;2012年01期

6 顧文波;;細(xì)胞周期與細(xì)胞同步化[J];生物學(xué)教學(xué);2011年06期

7 黃敏;;基因敲除技術(shù)及其應(yīng)用[J];廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào);2009年04期

8 李瑩;周劍忠;董明盛;;乳酸菌高密度培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展[J];中國(guó)乳業(yè);2008年10期

9 李今煜;陳健銘;彭振坤;;幾種常用的基因敲除技術(shù)[J];武夷科學(xué);2007年00期

10 萬海英;湯華;;基因敲除技術(shù)現(xiàn)狀及應(yīng)用[J];醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志;2007年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 莫日根;劉芮;薛海玲;姚瑤;格格恒;劉峰;范麗菲;;大腸桿菌細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制[A];中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)第九次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編（2009-2013）[C];2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 孫金威;保加利亞乳桿菌CcpA基因的敲除及其抗脅迫能力的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 王海娟;保加利亞乳桿菌細(xì)胞內(nèi)甜菜堿的轉(zhuǎn)運(yùn)及其調(diào)控蛋白初探[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2015年

3 王學(xué)良;相容性溶質(zhì)對(duì)L.bulgaricus 3的滲透保護(hù)作用及其對(duì)細(xì)胞膜影響研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2676399