【摘要】：韭蛆是危害多種蔬菜的主要害蟲,在我國多個省份均有報(bào)道,是蔬菜生產(chǎn)的大敵。韭蛆又稱根蛆主要危害韭菜,因棲居在韭菜根部,防治極難。隨著菜農(nóng)對化學(xué)農(nóng)藥的濫用和過分依賴,韭蛆的選擇壓力,其對各種化學(xué)藥劑的抗性逐漸增強(qiáng),使得韭蛆的防治受到的艱巨的挑戰(zhàn)。而分子生物學(xué)方面的研究尚未見報(bào)道,昆蟲的解毒酶系在其抵抗外界環(huán)境脅迫起到極其重要的作用。對其解毒酶機(jī)制中的關(guān)鍵解毒酶基因?qū)Σ煌袠?biāo)農(nóng)藥的表達(dá)水平的了解,有助于在分子水平上,尤其是從生態(tài)友好的角度上對昆蟲的防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。本文以高通量Illumina Hiseq 2000獲得的韭蛆轉(zhuǎn)錄組為背景,對不同處理樣本的韭蛆內(nèi)參引物進(jìn)行了系統(tǒng)的篩選,并對韭蛆ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞色素P450氧化酶系(CPY)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和非專一性酯酶(ESTs)關(guān)鍵解毒酶基因進(jìn)行克隆,同時對其4種解毒酶基因在辛硫磷、毒死蜱、吡蟲啉、氟嘧啶不同脅迫時間下的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行研究,具體結(jié)果如下:1.應(yīng)用Real-Time PCR技術(shù),在內(nèi)參基因的篩選中對RPL10、EF1α、G6PDH、UBC、ACT、RPS3、TUB、GAPDH、EF2α等九個候選內(nèi)參基因在23個不同處理樣本進(jìn)行了篩選。通過geNorm和Norm finder分析顯示,在不同發(fā)育時期最適內(nèi)參基因?yàn)锳CT,最適雙內(nèi)參基因?yàn)锳CT和EF2α;不同組織中最適內(nèi)參基因?yàn)镋F1α,最適雙內(nèi)參基因?yàn)镋F1-α和ACT;不同性別中最適的內(nèi)參基因?yàn)镽PL10,EF1-α和RPL10;不同農(nóng)藥脅迫下最適內(nèi)參基因?yàn)镽PL10,雙內(nèi)參基因?yàn)镽PL10和RPS3。2.對韭蛆4個解毒酶基因,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞色素P450氧化酶系(CPY)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和非專一性酯酶(ESTs)進(jìn)行了基因克隆,所獲得核苷酸序列分別為1275、1733、609、801個堿基。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明:韭蛆CPY基因與同屬雙翅目家族的家蠅CYP基因同源性最近,同源性高達(dá)97%,比其他昆蟲家族同源性更近;韭蛆GST基因與家蠅,黑果蠅同源性高達(dá)97%和96%,比其他昆蟲家族同源性更近;韭蛆EST基因與雙觸目蚊科埃及伊蚊和白紋伊蚊同源性達(dá)到98%,親緣關(guān)系比其他昆蟲家族同源性更近;韭蛆ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與岡比亞按蚊基因同源性為95%,親緣性比其他昆蟲家族同源性更近。3.應(yīng)用Real-Time PCR技術(shù)分析韭蛆在不同農(nóng)藥不同處理時間4種基因的表達(dá)水平。得到如下結(jié)果:本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在辛硫磷處理下谷胱甘-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)表達(dá)量變化不顯著,而ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及EST酶系表達(dá)量顯著提高。預(yù)測韭蛆對辛硫磷的解毒作用中,谷胱甘-S-轉(zhuǎn)移酶系不行使相應(yīng)解毒功能,而起到主要作用的是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及酯酶(EST)酶系。在毒死蜱脅迫下,四種解毒酶隨著時間基因表達(dá)量均顯著提高,尤其是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的提高最顯著,并且持續(xù)時間較長,說明在毒死蜱脅迫下ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白起到主要的解毒作用;在煙堿類農(nóng)藥(吡蟲啉)脅迫下,隨著時間除了谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)受影響較小以外,其他三種基因隨著時間的變化,均呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢,低于對照組表達(dá)水平。在煙堿類農(nóng)藥(吡蟲啉)脅迫下,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、EST、GST基因在第二天均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢,預(yù)測氟啶脲作用速度緩慢,還未影響到GST基因的表達(dá)水平。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S436.33

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本文編號：2675669