【摘要】：我國的蘋果(Malus domestica)栽培面積及產(chǎn)量均居世界首位,蘋果產(chǎn)業(yè)是支撐我國鄉(xiāng)村振興和農(nóng)民脫貧的重要產(chǎn)業(yè)。然而,水資源短缺嚴重威脅我國干旱、半干旱地區(qū)蘋果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。通過提高水分利用效率(Water Use Efficiency,WUE)實現(xiàn)節(jié)水農(nóng)業(yè),是保證我國旱區(qū)蘋果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的根本途徑。本研究以干旱條件下高WUE品種‘秦冠’和低WUE品種‘蜜脆’為親本構建的遺傳群體為試材,采用RAD-Seq(Restriction-site Associated DNA Sequencing)開發(fā)SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)標記,構建蘋果遺傳連鎖圖譜,評價不同供水條件下蘋果的WUE相關表型,并鑒定干旱條件下與蘋果WUE相關的數(shù)量性狀位點(Quantitative Trait Loci,QTL),篩選有效分子標記及關鍵調(diào)控基因,并對篩選的關鍵基因進行了克隆及功能鑒定,旨在為干旱下蘋果WUE分子機制研究和遺傳改良提供基本資料。主要研究結果如下:1.以‘蜜脆’x‘秦冠’F_1株系建立作圖群體,利用RAD測序技術開發(fā)SNP分子標記,經(jīng)過標記篩選分群,構建了1張由10172個SNP標記和350個單株組成的雙親遺傳連鎖圖譜。該圖譜由17條連鎖群(Linkage Group,LG)構成,總覆蓋遺傳距離2430.52cM,該圖譜標記類型和數(shù)量分別為:4421個lmxll型標記、1603個hkxhk型標記和4688個nnxnp標記,最長連鎖群為LG15,長度為179.97 cM,含有574個標記,最短連鎖群為LG9,長度為115.99 cM,含有590個標記;采用其中4421個lmxll型標記和930個hkxhk型標記構建母本‘蜜脆’圖譜,含有17條LG,遺傳距離1837.61 cM,標記密度0.34cM;采用其中4688個nn×np型標記和935個hk×hk型標記構建父本‘秦冠’圖譜,含有17條LG,遺傳距離1687.33cM,標記密度0.30 cM。2.對2014、2015兩年間,在中度干旱和正常供水條件下蘋果群體植株的莖生長量、葉面積、葉片水分狀況、葉片光合作用、水分利用效率等共計11項相關表型指標進行評價,并利用構建的遺傳圖譜進行QTL定位。群體表型評價結果表明,干旱使蘋果群體的生長受抑,比葉面積(SLA)減小,凈光合速率(Pn)、氣孔導度(gs)和蒸騰速率(Tr)下降,葉片保水力(WHC)降低,但干旱提高了蘋果的內(nèi)在水分利用效率(WUEi)和穩(wěn)定碳同位素組成(δ~(13)C)。另外,WUEi和δ~(13)C在兩種供水條件下均表現(xiàn)出較明顯的超親遺傳現(xiàn)象。各表型值在群體中均表現(xiàn)出連續(xù)的單峰分布,表明這些表型均為多基因控制的數(shù)量遺傳性狀;Shapiro-Wilk檢驗結果表明,干旱下相對含水量(RWC)、WHC、Pn、δ~(13)C的群體分布類型在年份間存在差異,說明這些性狀較其它性狀的環(huán)境效應更顯著。在兩年間,干旱條件下群體的WUEi均與Pn呈極顯著正相關關系,與gs、Tr呈極顯著負相關關系,而干旱下δ~(13)C均與總葉面積(TLA)、Pn呈顯著或極顯著正相關關系,與比葉面積(SLA)、Tr呈顯著負相關關系;群體同一表型在年份間均存在顯著或極顯著的正相關關系,表明測定指標在年份間的重復性較好。通過QTL定位,2014、2015兩年間,在中度干旱和正常供水條件下,我們共獲得與11項指標相關的266個QTL,包括22個與蘋果內(nèi)在WUE(WUEi)相關的QTL和33個與長期WUE(δ~(13)C)相關的QTL。其中,檢測到2個干旱下年份間共定位,即年份間穩(wěn)定的WUEi相關QTL:WUEiDS14.LG17.2和WUEiDS15.LG17,以及6個年份間穩(wěn)定的δ~(13)C相關QTL:δ13CDS14.LG8和δ13CDS15.LG8.1,δ13CDS14.LG15和δ13CDS15.LG15.1,δ13CDS14.LG16和δ13CDS15.LG16.1。檢測到22個“QTL熱點”區(qū)域,這些區(qū)域分別包含2~8個QTL。采用KASP分型技術證實了干旱脅迫下與δ~(13)C相關穩(wěn)定QTL定位的可靠性,并驗證了相關SNP標記lm1712(Chr8:12659110),np2623(Chr15:36996403)和np2691(Chr16:4666838)進行基因分型的有效性。3.在干旱下蘋果WUE相關穩(wěn)定QTL對應基因組區(qū)域進行基因篩選和表達分析,篩選到36個可能參與干旱下蘋果WUE調(diào)控的候選基因,它們涉及到光保護、信號轉(zhuǎn)導、物質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)運,或轉(zhuǎn)錄調(diào)控等生物學過程。其中,18個基因(MAPKKK、PP2A、GL1、ARF、ERF020、ATG4a、LAX、ATGP4、STN7、DnaJ、RLK、ARF17、GOLS1、MPL3、bZIP-1、VPS34、PIP5K1、TAT7等)在WUE差異品種‘秦冠’和‘蜜脆’中對干旱脅迫的表達響應模式或表達水平存在品種間差異,可作為優(yōu)先候選基因開展深入研究。這些基因的挖掘為干旱下蘋果WUE調(diào)節(jié)機制的研究和WUE的遺傳改良奠定了基礎。在篩選到的候選基因中,進一步克隆了一個位于δ~(13)C相關的穩(wěn)定QTL區(qū)間,顯著受干旱誘導的基因MDP0000217124。通過序列分析和多物種系統(tǒng)進化分析,確認該基因為蘋果DnaJ蛋白的編碼基因(MdDnaJ)。對該基因啟動子的順式作用元件進行分析表明,其啟動子區(qū)域包含18個與干旱、熱激、低溫、缺氧、防御和逆境響應等逆境脅迫響應和多種激素響應相關的順式作用元件。將MdDnaJ在擬南芥中過表達,對擬南芥轉(zhuǎn)基因株系進行了自然干旱脅迫結合復水和200 mM甘露醇滲透脅迫處理,結果表明,自然干旱20 d后,擬南芥轉(zhuǎn)基因株系葉片丙二醛含量、電解質(zhì)滲透率水平均低于野生型,而脯氨酸含量顯著高于野生型,轉(zhuǎn)基因株系δ~(13)C也顯著高于野生型,復水3 d后,3個轉(zhuǎn)基因株系的存活率分別達到64.0%、62.0%和55.3%,均明顯高于野生型(17.9%);甘露醇滲透脅迫對擬南芥野生型的生長抑制作用比轉(zhuǎn)基因株系更加顯著,逆境下各株系植株鮮重和根長高于野生型。將MdDnaJ在蘋果‘王林’愈傷組織中過表達,對轉(zhuǎn)基因愈傷進行150 mM甘露醇滲透脅迫處理,甘露醇滲透脅迫處理后,2個轉(zhuǎn)基因蘋果愈傷的鮮重、脯氨酸含量顯著高于對照,丙二醛含量、電解質(zhì)滲透率顯著低于對照。本研究結果表明,MdDnaJ基因具有提高植物耐旱、耐滲透脅迫和干旱下WUE的功能。
【圖文】：

2.1.2.2 RAD 文庫構建及測序參考 Chutimanitsakun et al.（2011）和 Wu et al.（2014）方法，利用提取的 gDNA 構建 RAD 文庫。首先應用限制性內(nèi)切酶 EcoRI 對基因組進行酶切，，然后分別對每個樣本進行物理打斷，構建 200~400bp 插入片段文庫。具體流程如圖 2-1 所示。（1）酶切：0.1-1μg 基因組 DNA 用限制性內(nèi)切酶 EcoRI 進行酶切，以得到適合的marker 密度；（2）加 P1 接頭：酶切后的片段兩端加 P1 Adapter（可與 EcoRI 酶切 DNA 缺口互補）；（3）片斷選擇：DNA 片段 pooling，隨機打斷到一定的片段，電泳回收 200bp-400bp的 DNA，末端平化后加 A；（4）加 P2 接頭：加 P2Adapter，P2 為局部雙鏈分叉 Y 型 DNA（可實現(xiàn)選擇性的擴增同時含有 P1 和 P2 接頭的 RAD tag）；（5）高通量測序：PCR 擴增兩端分別含有 P1 和 P2 接頭的 tag 序列，Cluster 制備，上機測序。參考Illumina步驟，利用 Illumina HiSeq2500測序平臺，進行雙末端（Paired-End250 測序。測序在北京諾禾致源科技有限公司完成。

4 ‘蜜脆’x‘秦冠’遺傳圖譜標記所在連鎖群與參考基因組染色體對應情況統(tǒng)計4 Statistics of the markers mapping linkage groups ('HC' x 'QG' genetic map) numbered iaccordance with the reference chromosome numbers連鎖群 Linkage Groups
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S661.1;S423

【參考文獻】

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本文編號：2674932