【摘要】：為了提高膽鹽水解酶在大腸桿菌中的表達(dá)量,研究重組膽鹽水解酶的酶學(xué)性質(zhì)。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),對(duì)雙歧桿菌來(lái)源的膽鹽水解酶進(jìn)行了表達(dá)。將PCR獲得的膽鹽水解酶基因克隆至表達(dá)載體p ET-22b(+),得到重組質(zhì)粒p ET-22b(+)-bsh,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化,重組菌在20℃、IPTG 1 mmol/L條件下誘導(dǎo)32 h可達(dá)最高酶活,對(duì)甘氨脫氧膽酸鈉和�；撬崦撗跄懰徕c的酶活分別為135.2 U/m L和121.3 U/m L。采用鎳親和層析柱對(duì)重組膽鹽水解酶進(jìn)行純化,經(jīng)SDS-PAGE分析,膽鹽水解酶相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為35.0×103。酶學(xué)性質(zhì)研究表明,重組膽鹽水解酶偏好水解甘氨結(jié)合膽鹽,對(duì)甘氨膽酸鈉的催化活性最高,達(dá)到220.1 U/mg。酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)經(jīng)Hill方程擬合,希爾系數(shù)大于1,表明底物與酶之間存在協(xié)同作用,且不同底物與重組膽鹽水解酶之間存在不同的協(xié)同作用,表明重組膽鹽水解酶屬于變構(gòu)酶。研究結(jié)果為其他來(lái)源膽鹽水解酶在基因工程菌中的表達(dá),和進(jìn)一步研究膽鹽水解酶的結(jié)構(gòu)和催化反應(yīng)機(jī)理提供了參考。

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