【摘要】：香菇(Lentinula edodes(Berk.)Pegler)是一種重要的白腐型真菌,主要通過分泌到胞外的木質(zhì)纖維素酶,以水解酶機制和氧化酶機制降解木質(zhì)纖維素。由于真菌木質(zhì)纖維素酶活與相應(yīng)酶基因的表達具有一致性,因而提高真菌胞外木質(zhì)纖維素降解相關(guān)酶基因表達水平對促進基質(zhì)有效利用具有重要意義。真菌木質(zhì)纖維素酶基因的表達受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控,但目前僅有少數(shù)白腐型真菌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子被報道。本課題組前期研究結(jié)果顯示,一個內(nèi)源性HMG-box轉(zhuǎn)錄因子LELCRP1蛋白(Lentinula edodes Lignocellulase Genes Regulation Protein 1)可能與香菇異核體菌株“武香一號”W1木質(zhì)纖維素降解相關(guān)酶基因的表達有關(guān)。本研究以香菇三磷酸甘油醛脫氫酶基因(legpdh)啟動子表達潮霉素抗性基因的p CAMBIA1300-g為載體骨架,通過double-joint法連接legpdh啟動子及l(fā)elcrp1基因反義鏈片段,采用同源重組法連接片段與線性化載體,構(gòu)建目標基因RNAi載體;采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化香菇異核體菌株W1菌絲,篩選得到4個沉默轉(zhuǎn)化子,其目標基因表達量分別下降至出發(fā)菌株的12.6%、16.5%、15.3%和16.2%。采用熒光定量PCR,對RNAi轉(zhuǎn)化子的27個木質(zhì)纖維素降解相關(guān)酶基因表達水平進行分析,發(fā)現(xiàn)其中9個纖維素酶基因、1個半纖維素酶基因、2個輔助酶AA9基因和1個錳過氧化物酶基因在基因表達水平上均表現(xiàn)出明顯的下調(diào)。Southern雜交和TAIL-PCR分析,證明以上13個下調(diào)表達的木質(zhì)纖維素酶基因與lelcrp1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。在纖維素+木質(zhì)素磺酸鈉(SLS)培養(yǎng)基中檢測香菇菌絲胞外酶活性,發(fā)現(xiàn)RNAi轉(zhuǎn)化子的濾紙纖維素酶(FPA)、纖維二糖水解酶(p NPCase)和錳過氧化物酶(Mn P)活性較W1顯著降低,其它酶的活性則無明顯變化,表明LELCRP1蛋白主要影響香菇纖維素酶和木質(zhì)素降解酶活性。在不同碳源基質(zhì)下的香菇菌絲生長試驗表明,RNAi轉(zhuǎn)化子在較單一的碳源培養(yǎng)基中,菌絲生長速度與出發(fā)菌株W1相比具有顯著性差異,且顯著慢于出發(fā)菌株,但在復(fù)雜的碳源基質(zhì)中生長速度差異并不明顯。以上試驗結(jié)果表明,香菇內(nèi)源性HMG-box結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子LELCRP1能夠調(diào)控部分木質(zhì)纖維素酶基因表達和相關(guān)酶的酶活性,并且影響香菇菌絲對某些碳源基質(zhì)的利用。本文為進一步深入研究香菇木質(zhì)纖維素降解酶基因表達調(diào)控的分子機制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò),提高香菇木質(zhì)纖維素類基質(zhì)轉(zhuǎn)化利用效率,奠定了初步的基礎(chǔ),具有重要的科學(xué)意義。
【圖文】：

-F GCACAATTACACCGACACGC-R AAGTATCCGAGCCGAACGAG-F CTGGACGACCGAATGCTACTG-R CTGCGAGTCGAAAGTGAAGGG-F CAGCGTGTTCTGATGTCTTGAT-R AGGAAATGACGAGGAAGCGA-F ATCCGACCAGGAACTTGAACC-R GCAGTAACCACGAGATTGAGG-F AACACTGAGAATCCCATAAAG-R GCCATCACAGTAGCGAGACCA-F GCATCCCTTCCACCTCCAT-R CGGGCACAACTCAGTCCAG-F GAGGAACTCACGAGGAAACA-R TGATTATTGGCTACGATGAACA TGGATTGCGTGGAGCCTTTG TCGGGACAGTACCGCTTTGG表 A/C/G/T。, N representsA/C/G/T.

后者具有 HMG-box 型轉(zhuǎn)錄因子典型的 DNA-binding 區(qū)域（圖3-1）。在 NCBI 上通過 CDS 翻譯的氨基酸序列對 LELCRP1 蛋白進行同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白與 Repressor ROX1 (L. edodes)的蛋白匹配率高達 99%，而且很早就與其它物種的蛋白分離，說明香菇 LELCRP1 和其它物種的 HMG-box 蛋白的同源性差異較大，是一種比較獨特的 HMG-box 蛋白（圖 3-2，附錄Ⅲ）。圖 3-1 香菇 LELCRP1 蛋白功能結(jié)構(gòu)域Fig 3-1 Functional motif of LELCRP1 in L. edodes圖 3-2 香菇 LELCRP1 蛋白同源性分析Fig 3-2 Homologous analysis of LELCRP1 in L. edodes
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S646.12

【參考文獻】

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本文編號：2672719