【摘要】：株型與作物的品質和產量密切相關,株型育種是作物育種的重要方向,而下胚軸的長度及葉型均是黃瓜株型構成的重要因素,對其調控基因進行研究,對于黃瓜理想株型的構建和株型改良具有重要意義。課題組通過前期的基因精細定位,獲得兩個與黃瓜株型性狀CsLH1(LONG HYPOCOTYL 1)和CsRL(ROUND LEAF)相關的候選基因,分別為控制黃瓜下胚軸伸長的候選基因CsNABP(Nucleic Acid-Binding Protein)和圓葉基因CsPID(PINOID)。本研究對這兩個候選基因分別進行了克隆并構建了相應的表達載體,通過農桿菌遺傳轉化初步驗證這兩個基因的功能。主要結果如下:1.CsNABP過表達載體和基因敲除載體的構建及在黃瓜中的遺傳轉化利用CRISPR/Cas9技術分別構建了CsNABP基因起始位點和核心功能區(qū)的敲除表達載體sgRNA1-Cas9-CsNABP和sgRNA2-Cas9-CsNABP;通過農桿菌介導CsNABP基因敲除載體對黃瓜進行了遺傳轉化,經PCR檢測,獲得9株轉sgRNA1-Cas9-CsNABP陽性株和2株轉sgRNA2-Cas9-CsNABP陽性株,初步推斷在CsNABP基因起始位點和核心功能區(qū)敲除載體的陽性轉化率分別為1.7%和0.95%。運用同源重組法構建了35S-CsNABP表達載體,經測序、核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn),CsNABP存在多個可變剪切體,故未對35S-CsNABP表達載體進行黃瓜遺傳轉化。2.CsPID基因調控的黃瓜圓葉突變體形態(tài)和光合特性分析黃瓜圓葉突變體C949的株高、莖粗等形態(tài)指標均顯著低于野生型,說明CsPID基因不僅控制了黃瓜的葉型,也影響了黃瓜其它器官的生長發(fā)育。在光合特性方面,突變體的葉綠素含量和凈光合速率顯著高于野生型。3.CsPID基因啟動子的功能缺失分析以黃瓜圓葉突變體DNA為模板,克隆不同長度的CsPID基因的啟動子序列,通過同源重組法構建相應的植物表達載體。將攜帶啟動子的農桿菌注射煙草葉片,經GUS基因瞬時表達驗證啟動子活性,結果表明,195bp以上的啟動子均具有活性;將不同長度的啟動子表達載體轉化擬南芥,啟動子活性驗證結果與在煙草中的結果相符;對T_1代擬南芥陽性株進行GUS染色,結果顯示CsPID啟動子主要在擬南芥植株的根系、葉片、花絮和種莢等組織中表達。4.CsPID過表達載體和基因敲除載體的構建及在黃瓜和擬南芥中的遺傳轉化以黃瓜CCMC的DNA為模板,擴增CsPID基因的CDS序列,用同源重組法構建了35S-CsPID過表達載體并進行黃瓜遺傳轉化,經PCR檢測獲得了22株35S-CsPID陽性株,T_0代35S-CsPID的陽性轉化率為3.4%;利用CRISPR/Cas9技術構建了CsPID基因敲除載體,經PCR檢測獲得11株sgRNA-Cas9-CsPID陽性株,對這些陽性轉基因株進行測序,結果表明,在靶序列附近無突變產生。將35S-CsPID過表達載體轉化擬南芥,T_2代陽性轉基因株出現(xiàn)側生初級花序增多,蓮座葉簇生且葉片變小等表型,與擬南芥中過表達AtPID(擬南芥PID)基因的表型具有部分相似性,這為證實CsPID基因是控制黃瓜圓葉基因Csrl的候選基因提供了有力的證據。
【圖文】：

黃瓜總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig2-1ThedetectionofRNAinCucumissativusL.

cDNA 為模板，利用位于2000bp上方，，與增成功。20001000750500250100M 1 黃瓜總 RNA 瓊脂糖凝e detection of RNA in Cuer；1：黃瓜 RNA M: DM 1
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S642.2

【參考文獻】

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1 解艷芳;牛顯飛;蔣學飛;劉雙雙;王茂林;;采用RNA-seq比較甘藍型油菜矮化突變體與其高稈親本的可變剪切[J];應用與環(huán)境生物學報;2018年01期

2 Dongli Gao;Chunzhi Zhang;Shu Zhang;Bowen Hu;Shenhao Wang;Zhonghua Zhang;Sanwen Huang;;Mutation in a novel gene SMALL AND CORDATE LEAF 1 affects leaf morphology in cucumber[J];Journal of Integrative Plant Biology;2017年10期

3 鄭蘭蘭;李琛;張t熻

本文編號：2672522