【摘要】：株型與作物的品質(zhì)和產(chǎn)量密切相關(guān),株型育種是作物育種的重要方向,而下胚軸的長度及葉型均是黃瓜株型構(gòu)成的重要因素,對其調(diào)控基因進行研究,對于黃瓜理想株型的構(gòu)建和株型改良具有重要意義。課題組通過前期的基因精細定位,獲得兩個與黃瓜株型性狀CsLH1(LONG HYPOCOTYL 1)和CsRL(ROUND LEAF)相關(guān)的候選基因,分別為控制黃瓜下胚軸伸長的候選基因CsNABP(Nucleic Acid-Binding Protein)和圓葉基因CsPID(PINOID)。本研究對這兩個候選基因分別進行了克隆并構(gòu)建了相應(yīng)的表達載體,通過農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化初步驗證這兩個基因的功能。主要結(jié)果如下:1.CsNABP過表達載體和基因敲除載體的構(gòu)建及在黃瓜中的遺傳轉(zhuǎn)化利用CRISPR/Cas9技術(shù)分別構(gòu)建了CsNABP基因起始位點和核心功能區(qū)的敲除表達載體sgRNA1-Cas9-CsNABP和sgRNA2-Cas9-CsNABP;通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)CsNABP基因敲除載體對黃瓜進行了遺傳轉(zhuǎn)化,經(jīng)PCR檢測,獲得9株轉(zhuǎn)sgRNA1-Cas9-CsNABP陽性株和2株轉(zhuǎn)sgRNA2-Cas9-CsNABP陽性株,初步推斷在CsNABP基因起始位點和核心功能區(qū)敲除載體的陽性轉(zhuǎn)化率分別為1.7%和0.95%。運用同源重組法構(gòu)建了35S-CsNABP表達載體,經(jīng)測序、核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn),CsNABP存在多個可變剪切體,故未對35S-CsNABP表達載體進行黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化。2.CsPID基因調(diào)控的黃瓜圓葉突變體形態(tài)和光合特性分析黃瓜圓葉突變體C949的株高、莖粗等形態(tài)指標均顯著低于野生型,說明CsPID基因不僅控制了黃瓜的葉型,也影響了黃瓜其它器官的生長發(fā)育。在光合特性方面,突變體的葉綠素含量和凈光合速率顯著高于野生型。3.CsPID基因啟動子的功能缺失分析以黃瓜圓葉突變體DNA為模板,克隆不同長度的CsPID基因的啟動子序列,通過同源重組法構(gòu)建相應(yīng)的植物表達載體。將攜帶啟動子的農(nóng)桿菌注射煙草葉片,經(jīng)GUS基因瞬時表達驗證啟動子活性,結(jié)果表明,195bp以上的啟動子均具有活性;將不同長度的啟動子表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥,啟動子活性驗證結(jié)果與在煙草中的結(jié)果相符;對T_1代擬南芥陽性株進行GUS染色,結(jié)果顯示CsPID啟動子主要在擬南芥植株的根系、葉片、花絮和種莢等組織中表達。4.CsPID過表達載體和基因敲除載體的構(gòu)建及在黃瓜和擬南芥中的遺傳轉(zhuǎn)化以黃瓜CCMC的DNA為模板,擴增CsPID基因的CDS序列,用同源重組法構(gòu)建了35S-CsPID過表達載體并進行黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化,經(jīng)PCR檢測獲得了22株35S-CsPID陽性株,T_0代35S-CsPID的陽性轉(zhuǎn)化率為3.4%;利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了CsPID基因敲除載體,經(jīng)PCR檢測獲得11株sgRNA-Cas9-CsPID陽性株,對這些陽性轉(zhuǎn)基因株進行測序,結(jié)果表明,在靶序列附近無突變產(chǎn)生。將35S-CsPID過表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥,T_2代陽性轉(zhuǎn)基因株出現(xiàn)側(cè)生初級花序增多,蓮座葉簇生且葉片變小等表型,與擬南芥中過表達AtPID(擬南芥PID)基因的表型具有部分相似性,這為證實CsPID基因是控制黃瓜圓葉基因Csrl的候選基因提供了有力的證據(jù)。
【圖文】：

黃瓜總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig2-1ThedetectionofRNAinCucumissativusL.

cDNA 為模板，利用位于2000bp上方，，與增成功。20001000750500250100M 1 黃瓜總 RNA 瓊脂糖凝e detection of RNA in Cuer；1：黃瓜 RNA M: DM 1
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S642.2

【參考文獻】

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本文編號：2672522