【摘要】：背景急性胰腺炎(AP)是常見(jiàn)的急性腹部炎性疾病,主要表現(xiàn)為腺泡細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激和胰腺炎癥,經(jīng)常由膽結(jié)石疾病或過(guò)量飲酒引起,目前仍有較高的發(fā)病率和死亡率。大部分急性胰腺炎患者的預(yù)后良好,可以完全治愈,但仍有大約20%的患者會(huì)有發(fā)生器官衰竭的風(fēng)險(xiǎn),急性胰腺炎患者是否有臟器功能衰竭以及持續(xù)時(shí)間決定了早期病情的嚴(yán)重程度。2012年美國(guó)亞特蘭大會(huì)議將急性胰腺炎分為輕癥、中度重癥和重癥急性胰腺炎3種。輕癥急性胰腺炎患者不合并臟器功能障礙,病死率幾乎為零;中度重癥急性胰腺炎患者往往伴有一過(guò)性器官功能衰竭(持續(xù)時(shí)間不超過(guò)48小時(shí)),病死率介于輕癥急性胰腺炎與重癥胰腺炎之間。病程當(dāng)中一旦出現(xiàn)持續(xù)性臟器功能障礙,很容易將患者劃分為輕度或重度胰腺炎,但對(duì)改善預(yù)后沒(méi)有幫助,只有在疾病的早期就能夠很好的預(yù)測(cè)急性胰腺炎疾病發(fā)展的進(jìn)程和結(jié)果,才能盡早的制定有效的治療方案以及采取干預(yù)措施,避免發(fā)生多臟器功能衰竭,從而改善預(yù)后。盡管許多單個(gè)生物預(yù)后標(biāo)志物和多個(gè)評(píng)分系統(tǒng)己經(jīng)被試用,但目前仍然沒(méi)有一個(gè)被廣泛接受的。因此,迫切需要尋找新的診斷和治療靶點(diǎn)來(lái)改善急性胰腺炎尤其是重癥患者的生存率。RNA干擾技術(shù)(RNAi)是最近幾年來(lái)新產(chǎn)生的一種在基因功能研究和基因治療上具有廣闊的應(yīng)用前景的生物技術(shù),因?yàn)樗膶?shí)施簡(jiǎn)單有效,并且研究表明應(yīng)用微量的siRNA即可達(dá)到使其編碼的致病基因產(chǎn)物的含量下降90%以上的目的,有的甚至可以達(dá)到完全基因敲除的效果,所以逐漸成為了代替基因敲除的有力工具。慢病毒載體是一種基因治療載體,具有極好的包裝能力,可以在不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞中維持長(zhǎng)期穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因的表達(dá),并且不出現(xiàn)病理?yè)p害現(xiàn)象。慢病毒載體具有廣泛的細(xì)胞趨性,無(wú)論對(duì)分裂細(xì)胞還是非分裂細(xì)胞均具有感染能力,可以容納片段比較大的外源性基因,是目前常用的RNA干擾技術(shù),它的發(fā)展形成了一個(gè)可以應(yīng)用于減少目標(biāo)基因的表達(dá)系統(tǒng)。雙特異性磷酸酶-1(DUSP1)又被稱(chēng)為絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP1),屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸酶家族中的一員,其表達(dá)受許多細(xì)胞外刺激物誘導(dǎo),包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和應(yīng)激等,對(duì)MAPK具有強(qiáng)有力的負(fù)監(jiān)管作用,DUSP1基因被認(rèn)為是腫瘤抑制因子和癌癥相關(guān)炎癥的調(diào)節(jié)器,更重要的是DUSP1在抗炎方面也發(fā)揮著重要的作用。絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是所謂的進(jìn)化守恒的絲氨酸和蘇氨酸蛋白酶,它參與到連接細(xì)胞表面受體和主要調(diào)節(jié)細(xì)胞核和細(xì)胞內(nèi)靶體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中。MAPKs被視為急性胰腺炎發(fā)展的早期階段的主要信號(hào)傳導(dǎo)器,在哺乳動(dòng)物中,有多種MAPK酶負(fù)責(zé)細(xì)胞增殖、凋亡、分化和存活。MAPK磷酸酶(包括DUSP1)可以通過(guò)MAPK脫磷酸化或干擾作用于MAPK的效應(yīng)分子結(jié)合,從而抑制信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞因子激活。急性胰腺炎病情加重甚至惡化的關(guān)鍵是在急性胰腺炎期間失去對(duì)多種炎癥介質(zhì)的控制,從而引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致胰腺組織的大量壞死,并因系統(tǒng)性多器官衰竭而變得更為復(fù)雜。就這一點(diǎn)而言,細(xì)胞因子的作用一直是關(guān)注的焦點(diǎn)。本研究旨在通過(guò)慢病毒載體沉默DUSP1從而增強(qiáng)MAPK信號(hào)通路的作用,PD98059作為MAPK信號(hào)通路的抑制劑抑制MAPK信號(hào)通路,觀察急性胰腺炎小鼠模型血清及組織中促炎因子的表達(dá)以及MAPK通路相關(guān)基因蛋白表達(dá)情況,探索其對(duì)促炎因子釋放的調(diào)控機(jī)制及對(duì)多臟器損傷的影響。目的通過(guò)慢病毒載體沉默DUSP1基因,觀察急性胰腺炎小鼠模型血清及組織中促炎因子的表達(dá)以及MAPK通路相關(guān)基因蛋白表達(dá)情況,探索慢病毒載體沉默DUSP1基因通過(guò)MPK通路介導(dǎo)急性胰腺炎小鼠促炎因子釋放的調(diào)控機(jī)制以及對(duì)多臟器損傷的影響。方法1.表達(dá)siRNADUSP1載體的構(gòu)建:設(shè)計(jì)2條siRNA和一條陰性對(duì)照序列siRNA1、5'-TAGCGTCAAGACATTTGCTGA-3',siRNA2、5'-CTGTACTATCCTGTAAATATA-3',scramble siRNA、5'-GGCAAGCTGACCCTGAAGTTC-3'檢測(cè)DUSP1的表達(dá)情況,篩選沉默效率高的siRNA。2慢病毒包裝及滴度測(cè)定選擇沉默效率高的siRNA,采用脂質(zhì)體法,分別與慢病毒包裝質(zhì)�；旌衔锕厕D(zhuǎn)染293T細(xì)胞,并進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。3小鼠急性壞死性胰腺炎模型制備及分組選取105只清潔級(jí)健康雄性KM小鼠,制模小鼠在實(shí)驗(yàn)前禁食12h,自由飲水。小鼠按4g/kg體質(zhì)量予腹腔內(nèi)注射20%L-精氨酸,分兩次腹腔內(nèi)注射,每次注射間隔1h,制備小鼠急性胰腺炎模型。按隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為7組,每組15只:(1)control組:健康小鼠,注射相同劑量的生理鹽水。(2)siRNA組:健康小鼠,腹腔注射0.88mg/kgDUSP1-siRNA慢病毒。(3)AP組:模型小鼠。(4)AP+PD98059組:在AP誘導(dǎo)前0.5h與誘導(dǎo)后1h腹腔注射PD98059 10mg/kg,其余各組采用相同劑量的生理鹽水代替PD98059。(5)AP+siRNA組:小鼠造模成功后,予以腹腔注射0.88mg/kgDUSP1-siRNA慢病毒。(6)AP+scramble組:小鼠造模成功后,予以腹腔注射0.88mg/kg scramble-siRNA慢病毒。(7)AP+PD98059+siRNA組:在AP誘導(dǎo)前0.5h與誘導(dǎo)后1h腹腔注射PD9805910mg/kg,造模成功后,予以腹腔注射0.88mg/kgDUSP1-siRNA慢病毒。各組小鼠分別在制模后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)即12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)經(jīng)全麻心臟取血(作為血液標(biāo)本),于建模48小時(shí)后處死小鼠,立即取得胰腺組織、肝臟組織、肺臟組織和腎臟組織。4 Elisa法檢測(cè)血清中促炎因子及HMGB1和S100A12含量于建模后12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí),分別選取各組5只小鼠行心臟取血,嚴(yán)格按照試劑盒要求采用Elisa方法檢測(cè)各組小鼠血清中促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)以及 HMGB1 和 S100A12 含量。5測(cè)定急性胰腺炎小鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平各組小鼠建模后12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)測(cè)定血清中淀粉酶、脂肪酶水平,各指標(biāo)的檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑包的要求進(jìn)行操作。6 HE染色將小鼠的胰腺、肝臟、腎臟和肺組織用4%甲醛固定,石蠟包埋切片,HE法進(jìn)行染色,用光學(xué)顯微鏡觀察各臟器組織病理學(xué)改變,并采取照片。7 RT-qPCR根據(jù)病毒核酸提取的說(shuō)明書(shū),通過(guò)試劑盒一步法提取組織標(biāo)本中的總RNA,并且測(cè)定總RNA的質(zhì)量和濃度。采用兩步法進(jìn)行提取RNA的逆轉(zhuǎn)錄。采用TaqMan探針?lè)ㄟM(jìn)行RT-qPCR檢測(cè),檢測(cè)各臟器組織中促炎因子(TNF-α、IL-1β和 IL-6)、DUSP1、HMGB1 和 S100A12 的 mRNA 表達(dá)量。8 Western提取各組胰腺、肝臟、腎臟和肺組織樣本,清除血液和其他組織,用超聲波粉碎。采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組織中DUSP1及MAPK通路相關(guān)基因蛋白的表達(dá)量。結(jié)果1.設(shè)計(jì)的siRNA2序列具有較高的沉默效率,采用pSIH-DUSP1-siRNA2包裝的慢病毒對(duì)293T細(xì)胞的感染率超過(guò)90%。2.與對(duì)照組相比,siRNA組中血清淀粉酶、脂肪酶水平以及血清和組織中的促炎因子、HMGB1和S100A12都有升高,但都無(wú)顯著差異;而在其他5組中各項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)顯著增加。3.與AP組相比,AP + siRNA組組織中DUSP1表達(dá)下降,而血清中各項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)明顯升高,并且組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1 和 S100A12mRNA的表達(dá)以及MAPK信號(hào)通路中相關(guān)基因蛋白p-ERK、p-JNK和p-p38的表達(dá)也明顯升高,胰腺組織的病理改變加重;AP + PD98059組血清中各項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)下降,并且組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1 和 S100A12mRNA的表達(dá)以及MAPK信號(hào)通路中相關(guān)基因蛋白p-ERK、p-JNK和p-p38的表達(dá)也下降,而胰腺組織的水腫程度減輕;AP+scramble組和AP+PD98059+siRNA組無(wú)顯著性差異。4.在各組急性胰腺炎小鼠模型中,血清中HMGB1和S100A12的表達(dá)水平與TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平呈正相關(guān)。5.與AP組相比,AP + siRNA組胰腺、肝臟、腎臟和肺組織的病理改變明顯加重,而AP + PD98059組胰腺、肝臟、腎臟和肺組織的病理改變減輕。結(jié)論1.采用pSIH-DUSP1-siRNA2包裝的慢病毒可以有效的抑制細(xì)胞中DUSP1的表達(dá)。2.在急性胰腺炎小鼠模型中DUSP1基因沉默可以促進(jìn)促炎因子的釋放,其作用機(jī)制可能是通過(guò)對(duì)MAPK信號(hào)通路中的ERK、JNK和p38的磷酸化而發(fā)揮其活性作用,增強(qiáng)了 MAPK信號(hào)通路的作用,從而促進(jìn)促炎細(xì)胞因子釋放。3.血清中HMGB1和S100A12的表達(dá)水平與TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平呈正相關(guān),提示作為MAPK信號(hào)通路的上游因子的HMGB1和S100A12與TNF-α、IL-1β和IL-6之間存在正反饋關(guān)系,共同促進(jìn)炎癥進(jìn)程的發(fā)展。4.TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1和S100A12的過(guò)度表達(dá)可以加重急性胰腺炎小鼠模型胰腺、肝臟、腎臟和肺組織的病理改變,從而更容易發(fā)生多臟器功能衰竭,加重急性胰腺炎的病情。5.早期檢測(cè)DUSP1的表達(dá)水平,可以提前預(yù)測(cè)發(fā)生多臟器功能衰竭的幾率,通過(guò)對(duì)DUSP1和MAPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)可以改變急性胰腺炎小鼠各臟器損傷的程度,為治療提供新的靶點(diǎn)。
【圖文】：

邐山東大學(xué)博士學(xué)位論文邐逡逑以后各孔熒光消失，而此孔陽(yáng)性細(xì)胞小于５個(gè)，則將該孔作為計(jì)量孔，計(jì)為１邋ＩＵ。逡逑計(jì)量陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為ｍ，用來(lái)計(jì)算病毒的滴度。計(jì)算公式為病毒滴度＝ｍｘ（ｌＩＵｘ計(jì)逡逑量孔相對(duì)于第１孔的稀釋倍數(shù)）／第１孔加入的病毒體積。逡逑３．結(jié)果逡逑３．１ｓｉＲＮＡ２沉默效率較高逡逑蛋白免疫印跡結(jié)果顯示（圖１），與空白組比較ＮＣ組ＤＵＳＰ１表達(dá)差異無(wú)逡逑統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ＞0．0５）。相比空白組，ｓｉＲＮＡＩ組ＤＵＳＰ１表達(dá)下降３５．５６％，逡逑ｓｉＲＮＡ２組下降５４．７２％，說(shuō)明ｓｉＲＮＡ２的沉默效率較高。因此，，采用逡逑ｐＳＩＨ－ＤＵＳＰ１－ｓｉＲＮＡ２與慢病毒包裝。逡逑Ａ逡逑

ｐＳＩＨ－ＤＵＳＰ１－ｓｉＲＮＡ２與慢病毒包裝。逡逑Ａ逡逑Ｂｌａｎｋ邋ＮＣ邋ｓｉＲＮＡＩ邋ｓｉＲＮＡ２邐５邋０邐？逡逑ＤＵＳＰ１邐＿邋丨＿邋丨丨邋＿邋丨＿．？丨邋ｓｏ－逡逑ｉ４。■邋■邋＿逡逑｜３－ａｃｔｉｎ邐＾邋２0＇逡逑１邋0ｉＶ－Ｖ—＾＿圖１由蛋白免疫印跡法檢測(cè)的各轉(zhuǎn)染組的ＤＵＳＰ１表達(dá)逡逑注：＊，與空白組和陰性對(duì)照組比較，尸＜０．０５；逡逑＃，與ｓｉＲＮＡＩ組比較，Ｚ５邋＜邋０．０５．逡逑３．２慢病毒滴度的測(cè)定和２９３Ｔ細(xì)胞感染結(jié)果逡逑病k斜懷曬Φ陌埃∈禿舐《炯械男Ъ凼牽擔(dān)叮玻

本文編號(hào)：2672255