【摘要】：三角帆蚌是我國(guó)重要的淡水珍珠蚌,有相關(guān)研究表明雄性三角帆蚌的產(chǎn)珠性能相較雌性具有優(yōu)勢(shì),三角帆蚌、雙殼綱乃至整個(gè)軟體動(dòng)物門(mén)的性別形成機(jī)制都缺乏系統(tǒng)性的探究,作為較為低等的動(dòng)物,性別表現(xiàn)形式的多樣性往往是性染色體上或胞質(zhì)性別相關(guān)基因和環(huán)境因素共同作用產(chǎn)生的結(jié)果。在高等脊椎動(dòng)物性別決定和分化中存在一些已被證實(shí)的信號(hào)通路基因,本實(shí)驗(yàn)選取了其中三個(gè)較為經(jīng)典的Transformer-2α,β-catenin和SOX2基因,對(duì)三角帆蚌這3個(gè)基因的序列、結(jié)構(gòu)、雌雄各組織表達(dá)、早期發(fā)育時(shí)期的表達(dá)以及細(xì)胞定位進(jìn)行研究,初步探討這些基因在三角帆蚌性別決定和性別分化的功能。另外在前期工作基礎(chǔ)上,對(duì)M型COII基因3’端特有序列的功能進(jìn)行初步研究,探討其在性別分化中的作用。1.三角帆蚌Transformer-2α基因的克隆與表達(dá)分析克隆得到了三角帆蚌的Transformer-2α的cDNA序列全長(zhǎng),為1867bp,其中包括92bp的5’非翻譯區(qū)和881bp的3’非翻譯區(qū),開(kāi)放閱讀框?yàn)?94bp,編碼297個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)其蛋白相對(duì)分子量為34661.2,理論等電點(diǎn)為11.02,不具備信號(hào)肽也不具備跨膜結(jié)構(gòu),具有RNA識(shí)別基序(RRM)和一個(gè)絲氨酸/精氨酸富集區(qū)域(SR)。熒光定量結(jié)果顯示Transformer-2α基因在雄性各組織的表達(dá)均高于所對(duì)應(yīng)的雌性組織,推測(cè)Transformer-2α基因在雌雄中存在不一樣的剪切體進(jìn)而導(dǎo)致性別朝不同方向分化。時(shí)期表達(dá)發(fā)現(xiàn)胚胎期3天左右存在一個(gè)表達(dá)峰值說(shuō)明可能在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。原位雜交結(jié)果顯示雌雄性腺中都存在信號(hào),說(shuō)明了該基因的雙向剪切功能。2.三角帆蚌β-catenin基因的克隆與表達(dá)分析克隆得到了三角帆蚌β-連環(huán)蛋白(β-catenin)基因的cDNA序列,全長(zhǎng)為5544bp,開(kāi)放閱讀框2463bp,編碼氨基酸820個(gè),5’非翻譯區(qū)1355bp,3’非翻譯區(qū)1726bp,沒(méi)有信號(hào)肽也沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)。蛋白結(jié)構(gòu)域中央為12個(gè)犰狳重復(fù)結(jié)構(gòu)域(ARM),該結(jié)構(gòu)域在物種間保守度極高。雌雄各組織的熒光定量結(jié)果顯示除外套膜外,雌性各組織的表達(dá)量都顯著高于雄性(P0.01),β-catenin基因本身就是親卵巢的基因,說(shuō)明其在雌性性腺發(fā)育過(guò)程中的重要性。時(shí)期定量在胚胎期第3天出現(xiàn)了峰值,推測(cè)參與了胚胎發(fā)育過(guò)程。原位雜交信號(hào)在雌性中較雄性較強(qiáng),總而言之,β-catenin基因在雌性性別形成中發(fā)揮舉足輕重的作用,而在雄性中并不是必需的。3.三角帆蚌SOX2基因的克隆與表達(dá)分析克隆了三角帆蚌的SOX2基因的cDNA序列,序列全長(zhǎng)為1840bp,5’UTR為163bp,3’UTR為1005bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?72bp,氨基酸223個(gè)。3’端存在AATAAA盒子和PolyA尾,3’UTR內(nèi)存在9個(gè)ATTTA單元。分子量為25136.15u,理論等電點(diǎn)為10.19,平均親水系數(shù)為-1.243,谷氨酰胺在氨基酸組成中所占比例最高,為10.3%,無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)。氨基酸序列包含由72個(gè)氨基酸組成的HMG-box和由48個(gè)氨基酸組成的SOXp結(jié)構(gòu)域,因此可以斷定屬于SOX家族基因。熒光定量結(jié)果顯示雌雄都在斧足中表達(dá)量最高,肝臟中基本不表達(dá),雌性性腺表達(dá)量顯著高于雌性,說(shuō)明了SOX2基因的多功能性。時(shí)期表達(dá)也顯示在3天左右最高,也參與到了胚胎的發(fā)育過(guò)程。原位雜交結(jié)果顯示雌性信號(hào)更強(qiáng)。4.M型COII基因的Western blot實(shí)驗(yàn)分析本課題組研究工作表明三角帆蚌線粒體基因序列中存在M型和F型COII基因2種不同序列,其中M型COII基因3’末端比F型多出546bp的序列,利用這一多余且猜測(cè)可能存在功能性的序列設(shè)計(jì)特異性抗體檢測(cè)雌雄各組織表達(dá),發(fā)現(xiàn)只存在雄性性腺,其余組織和雌性中基本沒(méi)有,蛋白層面上證明該基因在雄性中特異性表達(dá)。
【圖文】：

gacatatgacaaaaatgtttggaagcttgtaatcctacactttttgttcagcaatgtgctgcctcccagatgtaatgatttaacactaatatttaaaaggctttcttcaaattttagagttaagaacttgaactctttattatgactttaatttctaaaatcagaataaaacttggaaagagtttggttcttccatgtggactttgaattaacaacagtcagctgtaacagtagtatggactcatgttttcaggaagttttctttcagcctccagttcagttcagaatgtagcccaataaattgttttgtctgaaaataaaatgttacgctaaaaaaaaaaansformer-2α 基因的核苷酸和氨基酸序列，小寫(xiě)字編碼區(qū)，上面字母為核苷酸序列，下面字母為氨尾信號(hào)由下劃線標(biāo)出，RRM 結(jié)構(gòu)域序列由陰影部and deduced amino acid sequence of Transformer-2’,5’ untranslated regions; Uppercases was coding es sequence and the lower showed the amino acids; ion signals(AATAA) were underlined; The shado

圖 2-4 不同物種 Transformer-2α 基因氨基酸序列構(gòu)建的 NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。注：MEGA5.0 軟件的 NJ 法，節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字表示重復(fù) 1000 次的自舉（Bootstrap）Figure2-4 NJ phylogenetic tree of amino acid sequences of Transformer-2α gene speciesNote: NJ law contribution was made by MEGA5.0, the number on the node were bconfidence value repeated 1000 times.2.3 Transformer-2α 基因的組織表達(dá)在熒光定量檢測(cè)雌雄各組織表達(dá)量后發(fā)現(xiàn)，，Transformer-2α 基因在組織中均有表達(dá)，雌性組織和雄性組織中都是肝臟表達(dá)量最高，雌性外量最低，雄性斧足表達(dá)量最低。雌雄性腺中表達(dá)量都居于第二名，僅此同時(shí)利用 SPSS 單因素方差分析顯示肝臟中雌雄間存在顯著性差異，閉間則存在極顯著性差異�？傮w看來(lái)，Transformer-2α 基因在雄性各組織
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2670124