【摘要】：4-羥基異亮氨酸(4-hydroxyisoleucine,4-HIL)在胰島素分泌和胰島素抵抗方面起重要作用,因此有望應(yīng)用于糖尿病治療領(lǐng)域。早期研究中,將編碼異亮氨酸雙加氧酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)的基因ido在 L-異亮氨酸(L-isoleucine,Ile)生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌SN01中過表達(dá),得到菌株SN01/pJYW-4-ido(簡(jiǎn)稱SN02),可實(shí)現(xiàn)4-HIL的從頭合成。因此本文進(jìn)一步研究NADPH和底物的供應(yīng)對(duì)4-HIL合成的影響,主要結(jié)果如下:1、通過對(duì)表達(dá)NADPH相關(guān)基因或敲除絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的編碼基因pknG進(jìn)行研究,初步探討了 SN02菌株中4-HIL的合成與NADPH和胞內(nèi)α-酮戊二酸(2-oxoglutarate,OG)供應(yīng)的關(guān)系:1)過表達(dá)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶編碼基因zwf構(gòu)建ido-zwf表達(dá)菌SLO1;共表達(dá)zwf和NAD+激酶編碼基因ppnK構(gòu)建ido-zwf-ppnK表達(dá)菌SL02;過表達(dá)釀酒酵母BY4742來源的NADH激酶編碼基因POS5構(gòu)建ido-POS5表達(dá)菌SL05。經(jīng)144 h搖瓶發(fā)酵后,SL01和SL02菌株4-HIL產(chǎn)量以及4-HIL和Ile的總濃度均高于對(duì)照菌株SN02。說明過表達(dá)zwf和過表達(dá)zwf-ppnK有利于Ile的積累,對(duì)4-HIL合成也有一定的促進(jìn)作用。但SL05菌株中4-HIL未提高,Ile向4-HIL的轉(zhuǎn)化率僅為53.6%,說明僅過表達(dá)POS5不利于4-HIL的合成。2)分別對(duì)SL02和SL05菌株進(jìn)行ΔpknG::ido基因置換,構(gòu)建SL03和SL06菌株,經(jīng)144 h搖瓶發(fā)酵后,SL03和SL06菌株4-HIL產(chǎn)量較SN02菌株均有所提高,而且SL06菌株中Ile向4-HIL的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了 98.5%。說明在SL05菌株中通過ΔpknG::ido基因置換來促進(jìn)OG的供應(yīng)有利于4-HIL產(chǎn)量的提高。2、通過對(duì)能夠降低α-酮戊二酸脫氫酶(ODHC)活性編碼基因或增加溶氧的基因進(jìn)行表達(dá),初步探討了 SN02菌株中4-HIL的合成與OG和氧氣供應(yīng)的關(guān)系:為了加強(qiáng)OG的供應(yīng)并提高溶氧,分別構(gòu)建過表達(dá)ODHC抑制蛋白OdhI的編碼基因odhI構(gòu)建ido-odhI表達(dá)菌SL07和過表達(dá)odhI與透明顫菌血紅蛋白VHb的編碼基因vgb構(gòu)建ido-odhI-vgb表達(dá)菌SL08,經(jīng)144 h搖瓶發(fā)酵后,SL07和SL08菌株4-HIL產(chǎn)量分別為41.05±0.77 mmol/L和50.09±4.22 mmol/L,相較于對(duì)照菌株SN02并沒有明顯增加,但SL08菌株中L-谷氨酸、L-丙氨酸和L-賴氨酸(Lys)含量分別降低67.0%、48.4%和37.4%。3、為降低副產(chǎn)物L(fēng)ys的積累,分別在SN02和SL05菌株中敲除二氨基庚二酸脫氫酶編碼基因ddh構(gòu)建SL09和SLI0菌株。經(jīng)144 h搖瓶發(fā)酵后,SL09和SL10菌株4-HIL產(chǎn)量分別為 63.31±1.50 mmol/L 和25.49±2.51 mmol/L,Lys 產(chǎn)量分別為22.37±0.88 mmol/L和25.80±2.61 mmol/L,相較于對(duì)照菌株SN02(28.11±1.72 mmol/L),SL09和SL10菌株中Lys產(chǎn)量分別降低20.4%和8.2%。
【圖文】：

irnov 等于 2010 年利用分子生物學(xué)手段將蘇云金芽孢桿菌 2e2 中的 idoEscherichia coli）中過表達(dá)，并以外源添加的 Ile、菌株自身合成的α-glutarate, OG）和氧氣為底物，經(jīng) IDO 催化成功實(shí)現(xiàn)一步法合成 4-HIL勢(shì)在于過表達(dá) ido 后，敲除異檸檬酸脫氫酶激酶編碼基因 aceK，使異活性，繼續(xù)合成 OG，再敲除異檸檬酸裂解酶編碼基因 aceA 和α-酮戊基因 sucAB，阻斷了琥珀酸的合成，將 4-HIL 的合成與 TCA 循環(huán)和菌。補(bǔ)料分批發(fā)酵 20 h 后，大腸桿菌 MG1655 2Δ（ΔaceAKΔsucAB）總耗，發(fā)現(xiàn)每 100 mmol/L 的 Ile 可轉(zhuǎn)化為 82 mmol/L 的 4-HIL。該團(tuán)隊(duì)又于菌代謝途徑中的代謝流進(jìn)行優(yōu)化，，如阻斷 ED 途徑，但未影響菌株的戊糖途徑后，菌株代謝雖然受到影響，但有更多的碳源進(jìn)入 TCA 循環(huán)20 h 后，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌 MG1655 2ΔΔ（ΔaceAKΔsucABΔzwfΔeddΔeda） 2Δ菌株少 20.1%，菌體濃度降低了 35.3%，每 200 mmol/L 的 Ile 可轉(zhuǎn) 的 4-HIL，最終 Ile 到 4-HIL 的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了 88.0%[21]。但該方法需要，無疑會(huì)使生產(chǎn)成本大大增加，因此尋找一株可自身生產(chǎn)大量 Ile 的菌

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文 步反應(yīng)合成 Ile 的部分代謝圖。如圖所示，在 Ile 合并積累中間產(chǎn)物 Thr，會(huì)造成合成 Ile 的部分碳流，通過代謝工程改造代謝途徑，減少副產(chǎn)物和中間如，在 Ile 合成途徑中，Lys 的積累相比較其他雜酸 Lys 合成途徑中的二氫吡啶二羧酸合酶的編碼基因 的產(chǎn)量降低[23]。在 Ile 合成途徑中天冬氨酸激酶（A反饋抑制，高絲氨酸脫氫酶（HSD）和高絲氨酸激的反饋抑制[24]。因此提高 Ile 產(chǎn)量常用的手段就是過定點(diǎn)突變技術(shù)，達(dá)到解除反饋抑制的目的。 產(chǎn)量的手段外，NADPH 的供應(yīng)對(duì)于 Ile 的合成是非0 步反應(yīng)中有 4 步反應(yīng)需要 NADPH，因此通過提高 的產(chǎn)量。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 高峰;蔡琴;蔡倫;盧芙蓉;;4-羥基異亮氨酸的研究現(xiàn)狀[J];醫(yī)藥導(dǎo)報(bào);2014年10期

2 劉玲;丁永良;張國林;;4-羥基異亮氨酸的研究進(jìn)展[J];天然產(chǎn)物研究與開發(fā);2006年03期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 王雨舟;惡臭假單胞菌KT2442鞭毛關(guān)鍵調(diào)控基因?qū)晟飳W(xué)特性的影響[D];江南大學(xué);2018年

2 盧正珂;重組谷氨酸棒桿菌合成4-羥基異亮氨酸的前體供應(yīng)代謝工程改造[D];江南大學(xué);2018年

3 方惠敏;表達(dá)ido的重組谷氨酸棒桿菌代謝途徑改造以提高4-羥基異亮氨酸的產(chǎn)量[D];江南大學(xué);2016年

本文編號(hào)：2669941