【摘要】：結球甘藍(Brassica oleracea L.var.capitata)是十字花科蕓薹屬甘藍種七個變種之一,是世界范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟作物之一。農(nóng)桿菌介導的甘藍遺傳轉(zhuǎn)化研究始于上世紀80年代,但轉(zhuǎn)化效率低、穩(wěn)定性差仍是困擾其轉(zhuǎn)化的關鍵�；ㄉ侵参锏闹匾誀�,既可作為視覺信號吸引昆蟲為其進行授粉,又能保護植物不受傷害。自然界中甘藍類作物的花色一般為黃色,且花瓣中的主要色素成分為類胡蘿卜素。先前已經(jīng)完成了對甘藍花色基因BolC.cpc-1的精細定位及候選基因分析。為了驗證該基因的功能,本研究構建花色基因BolC.cpc-1的過表達載體pBWA(V)BS-BolC.cpc-1,同時以黃花結球甘藍自交系YL-1為材料,建立農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化體系。在此基礎上,通過農(nóng)桿菌介導對YL-1進行遺傳轉(zhuǎn)化,并對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行分子檢測、表型觀察及BolC.cpc-1基因RT-PCR表達分析。主要結果如下:(1)成功構建了花色基因BolC.cpc-1的過表達載體pBWA(V)BS-BolC.cpc-1。根據(jù)已克隆的候選基因BolC.cpc-1序列設計引物,以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進行PCR擴增,獲得全長為1791 bp的CDS序列。利用內(nèi)切酶Eco31I對凝膠回收產(chǎn)物和載體進行酶切后,利用一步法同源克隆試劑盒將目的片段連接到空載質(zhì)粒,獲得重組載體pBWA(V)BS-BolC.cpc-1。(2)篩選出高效轉(zhuǎn)化受體材料YL-1,并建立了其轉(zhuǎn)化體系。以四份結球甘藍自交系下胚軸和具柄子葉為材料,研究基因型對再生頻率的影響,結果發(fā)現(xiàn)YL-1為最優(yōu)轉(zhuǎn)化材料。進一步以結球甘藍自交系YL-1下胚軸和具柄子葉為試材,研究外植體類型、光照強度、苗齡、除草劑濃度、農(nóng)桿菌侵染濃度、乙酰丁香酮濃度以及共培養(yǎng)溫度對不定芽再生的影響。YL-1的具柄子葉和下胚軸再生能力無顯著差異,均可以用于遺傳轉(zhuǎn)化;光照強度為4000 lx時最有利于YL-1不定芽再生;苗齡5 d時,YL-1下胚軸和具柄子葉的分化再生能力最強;除草劑Baster濃度為8 mg·L~(-1)時,YL-1兩種類型的外植體均完全停止分化甚至死亡,因而將該濃度作為最低篩選濃度;農(nóng)桿菌濃度OD_(600)=0.3時對YL-1侵染8 min,除草劑抗性芽再生頻率最高;乙酰丁香酮對YL-1遺傳轉(zhuǎn)化的影響作用不大,濃度過高甚至會降低不定芽的再生頻率;農(nóng)桿菌侵染過后將外植體置于共培養(yǎng)溫度為25℃的條件下可獲得較高再生頻率。(3)獲得轉(zhuǎn)化BolC.cpc-1基因的植株,并進行了PCR驗證。利用構建的過表達載體,基于已建立的遺傳轉(zhuǎn)化體系,對結球甘藍YL-1進行遺傳轉(zhuǎn)化,目前共獲得47株抗性苗。以載體特異性引物Pboc-1及除草劑標記Bar-2對轉(zhuǎn)基因植株進行PCR擴增檢測。結果表明,12株抗性苗為PCR陽性,初步表明該基因已經(jīng)整合進受體基因組中,轉(zhuǎn)化率達到2.18%。(4)轉(zhuǎn)過表達載體植株的花色由黃變白,驗證了BolC.cpc-1基因在花色變異中的功能�；ㄆ谟^察轉(zhuǎn)基因植株的表型,發(fā)現(xiàn)花瓣顏色表現(xiàn)出不同程度的變淺,其中一株為完全白色。對轉(zhuǎn)基因陽性植株、受體材料、白花親本材料花瓣中BolC.cpc-1基因表達情況進行RT-PCR分析,結果顯示:BolC.cpc-1在受體材料中不表達,在YF-2中表達量與11-192相近,其余轉(zhuǎn)基因陽性植株中,花色越淺,該基因的表達量越高。由此推測,BolC.cpc-1基因參與調(diào)控結球甘藍花瓣中類胡蘿卜素的降解,使得甘藍花色由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榘咨?br>【圖文】：

olC.cpc-1 基因 cDNA 的1 Cloning of BolC.cpc-1 g酶切驗證(V)BS-ccdb 并轉(zhuǎn)化到大，獲得與重組質(zhì)粒中大，出現(xiàn)符合預期的 21未列出)，表明重組載結構示意圖如圖 4.3。

產(chǎn)物過夜培養(yǎng)后隨機挑取單克隆搖菌檢測，，獲得與重組質(zhì)粒中大小(2098 bp)一致的條帶(圖4.2a)。抽提質(zhì)粒進行酶切驗證，出現(xiàn)符合預期的 2161 bp 條帶(圖 4.2b)，回收測序結果與 cDNA 序列一致(數(shù)據(jù)未列出)，表明重組載體已構建成功，命名為pBWA(V)BS-BolC.cpc-1。載體結構示意圖如圖 4.3。200010001791bpM 1
【學位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S635.1

【參考文獻】

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本文編號：2669221