【摘要】：結(jié)球甘藍(lán)(Brassica oleracea L.var.capitata)是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種七個(gè)變種之一,是世界范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)遺傳轉(zhuǎn)化研究始于上世紀(jì)80年代,但轉(zhuǎn)化效率低、穩(wěn)定性差仍是困擾其轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵�；ㄉ侵参锏闹匾誀�,既可作為視覺(jué)信號(hào)吸引昆蟲(chóng)為其進(jìn)行授粉,又能保護(hù)植物不受傷害。自然界中甘藍(lán)類作物的花色一般為黃色,且花瓣中的主要色素成分為類胡蘿卜素。先前已經(jīng)完成了對(duì)甘藍(lán)花色基因BolC.cpc-1的精細(xì)定位及候選基因分析。為了驗(yàn)證該基因的功能,本研究構(gòu)建花色基因BolC.cpc-1的過(guò)表達(dá)載體pBWA(V)BS-BolC.cpc-1,同時(shí)以黃花結(jié)球甘藍(lán)自交系YL-1為材料,建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)對(duì)YL-1進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,并對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子檢測(cè)、表型觀察及BolC.cpc-1基因RT-PCR表達(dá)分析。主要結(jié)果如下:(1)成功構(gòu)建了花色基因BolC.cpc-1的過(guò)表達(dá)載體pBWA(V)BS-BolC.cpc-1。根據(jù)已克隆的候選基因BolC.cpc-1序列設(shè)計(jì)引物,以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得全長(zhǎng)為1791 bp的CDS序列。利用內(nèi)切酶Eco31I對(duì)凝膠回收產(chǎn)物和載體進(jìn)行酶切后,利用一步法同源克隆試劑盒將目的片段連接到空載質(zhì)粒,獲得重組載體pBWA(V)BS-BolC.cpc-1。(2)篩選出高效轉(zhuǎn)化受體材料YL-1,并建立了其轉(zhuǎn)化體系。以四份結(jié)球甘藍(lán)自交系下胚軸和具柄子葉為材料,研究基因型對(duì)再生頻率的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)YL-1為最優(yōu)轉(zhuǎn)化材料。進(jìn)一步以結(jié)球甘藍(lán)自交系YL-1下胚軸和具柄子葉為試材,研究外植體類型、光照強(qiáng)度、苗齡、除草劑濃度、農(nóng)桿菌侵染濃度、乙酰丁香酮濃度以及共培養(yǎng)溫度對(duì)不定芽再生的影響。YL-1的具柄子葉和下胚軸再生能力無(wú)顯著差異,均可以用于遺傳轉(zhuǎn)化;光照強(qiáng)度為4000 lx時(shí)最有利于YL-1不定芽再生;苗齡5 d時(shí),YL-1下胚軸和具柄子葉的分化再生能力最強(qiáng);除草劑Baster濃度為8 mg·L~(-1)時(shí),YL-1兩種類型的外植體均完全停止分化甚至死亡,因而將該濃度作為最低篩選濃度;農(nóng)桿菌濃度OD_(600)=0.3時(shí)對(duì)YL-1侵染8 min,除草劑抗性芽再生頻率最高;乙酰丁香酮對(duì)YL-1遺傳轉(zhuǎn)化的影響作用不大,濃度過(guò)高甚至?xí)档筒欢ㄑ康脑偕l率;農(nóng)桿菌侵染過(guò)后將外植體置于共培養(yǎng)溫度為25℃的條件下可獲得較高再生頻率。(3)獲得轉(zhuǎn)化BolC.cpc-1基因的植株,并進(jìn)行了PCR驗(yàn)證。利用構(gòu)建的過(guò)表達(dá)載體,基于已建立的遺傳轉(zhuǎn)化體系,對(duì)結(jié)球甘藍(lán)YL-1進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,目前共獲得47株抗性苗。以載體特異性引物Pboc-1及除草劑標(biāo)記Bar-2對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。結(jié)果表明,12株抗性苗為PCR陽(yáng)性,初步表明該基因已經(jīng)整合進(jìn)受體基因組中,轉(zhuǎn)化率達(dá)到2.18%。(4)轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)載體植株的花色由黃變白,驗(yàn)證了BolC.cpc-1基因在花色變異中的功能�；ㄆ谟^察轉(zhuǎn)基因植株的表型,發(fā)現(xiàn)花瓣顏色表現(xiàn)出不同程度的變淺,其中一株為完全白色。對(duì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株、受體材料、白花親本材料花瓣中BolC.cpc-1基因表達(dá)情況進(jìn)行RT-PCR分析,結(jié)果顯示:BolC.cpc-1在受體材料中不表達(dá),在YF-2中表達(dá)量與11-192相近,其余轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中,花色越淺,該基因的表達(dá)量越高。由此推測(cè),BolC.cpc-1基因參與調(diào)控結(jié)球甘藍(lán)花瓣中類胡蘿卜素的降解,使得甘藍(lán)花色由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榘咨?br>【圖文】：

olC.cpc-1 基因 cDNA 的1 Cloning of BolC.cpc-1 g酶切驗(yàn)證(V)BS-ccdb 并轉(zhuǎn)化到大，獲得與重組質(zhì)粒中大，出現(xiàn)符合預(yù)期的 21未列出)，表明重組載結(jié)構(gòu)示意圖如圖 4.3。

產(chǎn)物過(guò)夜培養(yǎng)后隨機(jī)挑取單克隆搖菌檢測(cè)，，獲得與重組質(zhì)粒中大小(2098 bp)一致的條帶(圖4.2a)。抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，出現(xiàn)符合預(yù)期的 2161 bp 條帶(圖 4.2b)，回收測(cè)序結(jié)果與 cDNA 序列一致(數(shù)據(jù)未列出)，表明重組載體已構(gòu)建成功，命名為pBWA(V)BS-BolC.cpc-1。載體結(jié)構(gòu)示意圖如圖 4.3。200010001791bpM 1
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S635.1

【參考文獻(xiàn)】

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