【摘要】：目的:探究ras癌基因誘發(fā)肝腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,在代謝組學和轉(zhuǎn)錄組學水平上的變化特點,為研究肝腫瘤的發(fā)病機制及臨床診斷治療提供有益的線索。方法:1.將Hras12V轉(zhuǎn)基因小鼠肝腫瘤組織和正常小鼠肝組織切成1 cm~3小塊,用冰浴的生理鹽水沖洗,立即凍存進液氮中用于后續(xù)氣相質(zhì)譜分析和總RNA提取實驗。剩余的組織存放在10%福爾馬林液中,用于組織病理學鑒定,確認是否可以用于后續(xù)實驗。2.制備氣相色譜-質(zhì)譜分析所需樣本,進行GC-MS兩個衍生化步驟,混合后上機待測。隨后進行GC-TOF-MS檢測;然后進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用設備的分析數(shù)據(jù)分析,用LECO Corporation和LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫的色度TOF4.3X軟件用來區(qū)分出原始物質(zhì),數(shù)據(jù)用基線過濾及基線校準、峰值對齊、去卷積分析、峰值識別和峰值區(qū)域集成,將產(chǎn)生的物質(zhì)列表輸入Pirouette software(模式識別,華盛頓伍丁維爾)用于多變量的統(tǒng)計學分析。將氣相液相色譜-質(zhì)譜列出的物質(zhì)數(shù)據(jù)表輸入MSEA作為代謝物列表,選擇小鼠通路庫,同時ORA算法選擇超幾何檢驗進行代謝物富集分析。3.檢測兩組肝組織樣本中不同基因mRNA的表達量。抽提待測樣本的總RNA,用TruSeq RNA LT樣本準備試劑盒制備測序文庫,測序用Illumina HiSeq 2000。對UCSC Mouse Reference Genome(http://genome.ucsc.edu/)進行閱讀比對用Tophat v1.3.2軟件。DAVID v6.7數(shù)據(jù)庫用于測序數(shù)據(jù)分析和KEGG富集分析。4.實驗室對部分代謝物用試劑盒進行檢測,包括:NADPH、甘油三酯、膽固醇、丙酮酸、乳酸、膽汁酸、谷胱甘肽和活性氧。以上代謝物檢測方法嚴格按照相關(guān)試劑盒說明書進行。所有待測樣本進行三次實驗。結(jié)果:1.肝癌當中富含脂質(zhì)與大體表型一致,HCC的脂質(zhì)生物合成是顯著增強的;2.糖酵解途徑和檸檬酸穿梭的增強提供了充足的乙酰輔酶A;強化的磷酸戊糖途徑供應非常多的NADPH;3.脂質(zhì)從頭合成相關(guān)性關(guān)鍵性酶活性都上調(diào);與膽汁酸合成有關(guān)的重要酶的活性全下調(diào);4.肝癌組織與正常肝組織相比較,NADPH、丙酮酸、甘油三酯、膽固醇以及谷胱甘肽含量顯著升高,乳酸含量顯著性下降,而活性氧維持在正常水平。結(jié)論:在ras癌基因誘導的肝癌中,脂質(zhì)代謝、糖酵解、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環(huán)、檸檬酸穿梭、膽汁酸合成和氧化還原穩(wěn)態(tài)有顯著紊亂,而且這些發(fā)生變化的代謝過程對肝癌的發(fā)生發(fā)展和病理特點有起到關(guān)鍵性作用。
【圖文】：

組織病理學鑒定由 ras 癌基因誘導的肝癌組織中代謝組學和轉(zhuǎn)錄組因雄性小鼠肝腫瘤組織和正常雄性小鼠肝組織作為本和組織病理學研究結(jié)果與我們之前的研究報道一色病灶，病灶呈圓形或橢圓形伴有豐富血管，質(zhì)地ras 轉(zhuǎn)基因雄鼠肝臟病灶是突出肝表面或嵌入肝臟內(nèi)雄性小鼠肝組織鮮紅色，質(zhì)地有彈性且未見病灶（顯示肝癌（通常直徑大于 5 mm）有腫瘤細胞小梁排跡象和淋巴細胞浸潤跡象（圖 1C）。正常肝組織中和炎癥細胞浸潤（圖 1D）。所有的取材實驗動物其別了 8 只 ras 轉(zhuǎn)基因雄鼠肝癌組織和 8 只正常雄鼠行后續(xù)研究。

圖 2 對肝癌組織和正常肝組織的代謝數(shù)據(jù)進行 PCA，PLS-DA 和 OPLS-DA 分析注釋 2：（A）正常肝組織（用黑色圓點表示），肝癌組織（用藍色菱形表示），基于兩種組織的代謝物配置數(shù)據(jù)進行 PCA 繪制評分圖。主要成分 PC1 (t[1]) 和PC2 (t[2])分別描述了 33.6%和 15.6%變異，每組 n=8。（B）PLS-DA 評分顯示出正常肝組織（用黑色圓點表示）和肝癌組織（用藍色菱形表示）是完全分離的兩種組織。分類參數(shù)：R2X (cum) = 0.539，R2Y (cum) = 0.951，，and Q2 (cum) = 0.746。（C）PLS-DA 模型驗證對正常肝組織（用黑色圓形表示）和肝癌組織（用藍色菱形表示）進行 200 次數(shù)據(jù)隨機排列，顯示 R2 低于 0.515 并且 Q2 低于 0.173。（D）OPLS-DA 顯示出正常肝組織（用黑色圓形表示）和肝癌組織（用藍色菱形表示）之間區(qū)別的變量分攤。分類參數(shù)：R2X (cum) = 0.816，R2Y (cum) = 0.996，和 Q2 (cum) = 0.874。3 PCA 篩選出的肝癌組織和正常肝組織之間有差異的物質(zhì)除了基于樣本組成的成分得分圖以外，PCA 還可以根據(jù)代謝物含量生成一個
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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本文編號：2668027