【摘要】：SWEETs(Sugars Will Eventually be Exported Transporters)是高等植物中一類全新的不依賴能量介導(dǎo)糖轉(zhuǎn)運的易化擴散蛋白家族,對調(diào)控作物產(chǎn)量形成中碳素轉(zhuǎn)運與分配具有重要意義,目前僅在植物的葉片、花器官鑒定了部分成員的生理功能,而作為重要“庫”組織的果實器官中介導(dǎo)蔗糖供給與代謝積累的生理功能和調(diào)控機理尚無報道。本文以番茄基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),利用生物信息學(xué)方法在番茄中鑒定了SlSWEETs基因家族成員。通過實時定量PCR分析篩選獲得了果實特異表達(dá)的SlSWEETs基因,并利用Gateway技術(shù)構(gòu)建SlSWEETs-RNAi沉默載體,獲得轉(zhuǎn)基因株系并對其進(jìn)行分析,進(jìn)一步探討SlSWEETs在番茄果實成熟過程中調(diào)控蔗糖轉(zhuǎn)運的分子機理以及蔗糖積累與糖轉(zhuǎn)化蛋白活性的關(guān)系。此外,利用酵母己糖缺陷型突變體驗證番茄果實中差異表達(dá)的SlSWEETs蛋白所具有的糖轉(zhuǎn)運特性。同時利用mbSUS泛素裂解化酵母膜蛋白雙雜系統(tǒng)和BiFC雙分子熒光互補系統(tǒng)對篩選出的SlSWEETs蛋白進(jìn)行互作分析。通過對SlSWEETs基因啟動子分析,初步研究在不同激素處理下SlSWEETs的表達(dá)模式,并為栽培番茄果實產(chǎn)量和品質(zhì)的遺傳改良提供理論依據(jù)及新思路。主要研究結(jié)果如下:1.以番茄基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),在番茄中鑒定了29個SlSWEETs基因家族成員,序列比對發(fā)現(xiàn)番茄SlSWEETs家族成員均含有7個跨膜結(jié)構(gòu)域,包括2個典型的3-跨膜MtN3保守結(jié)構(gòu)域以及一個連接用的α-螺旋跨膜結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析SlSWEETs家族成員可以分成典型的四大分支,其中分支I、II和IV成員具有己糖轉(zhuǎn)運能力,而分支III的成員優(yōu)先轉(zhuǎn)運蔗糖,但是也具有一定的己糖轉(zhuǎn)運能力。通過糖、鹽和溫度脅迫處理,對SlSWEETs基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析,并篩選出了響應(yīng)逆境脅迫的SlSWEETs基因。其中SlSWEET1b、-1c、-5b、-6a和-7a可能參與葡萄糖的運輸,SlSWEET10a、-10b、-10c、-11a、-11b、-11d、-12a和-12c可能參與果糖的運輸,SlSWEET10a、-10b、-10c、-11a、-11b、-11c、-11d和-12c可能在蔗糖的運輸過程中起重要作用。SlSWEET1c、-2a、-3、-7a和-14在高溫脅迫下起作用,SlSWEET1c、-1f、-3、-5a和-5b可能在低溫脅迫下誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄,SlSWEET1c、-3、-7a和-14在鹽脅迫響應(yīng)中起重要作用。在此基礎(chǔ)上,對比已公開數(shù)據(jù)庫中獲得了栽培型番茄“Heinz 1706”(S.lycopersicum)和野生型番茄LA1598(S.pimpinellifolium)的SlSWEETs基因表達(dá)譜,篩選出了SlSWEET7a、-11b、-12c和-14這4個在果實高度表達(dá)的基因,推測其可能在果實發(fā)育成熟過程中發(fā)揮著更為重要的作用。2.為進(jìn)一步驗證SWEET在番茄果實中的功能,本實驗室構(gòu)建了4個SlSWEETs基因的沉默載體,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入Micro-TOM番茄中,經(jīng)PCR鑒定及目的基因的實時定量PCR分析,已全部獲得沉默轉(zhuǎn)基因株系。通過對沉默轉(zhuǎn)基因株系成熟葉片及果實的糖含量測定發(fā)現(xiàn),基因沉默后,成熟葉中的糖含量積累增加,果實的己糖含量也有增加,但是蔗糖含量變化不大,說明SlSWEETs家族成員之間存在功能冗余。對slsweet7a-1和slsweet14沉默轉(zhuǎn)基因株系果實中蔗糖代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)分析,結(jié)果表明,基因沉默后,slsweet7a-1果實內(nèi)果糖激酶FK和己糖激酶HK的表達(dá)量下調(diào),蔗糖代謝相關(guān)的酶基因(蔗糖磷酸合成酶SPSA2、細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶LIN、液泡轉(zhuǎn)化酶VI)和糖轉(zhuǎn)運蛋白基因(SlSWEET12c和SlSWEET14)的表達(dá)量上調(diào)。slsweet14果實內(nèi)只有蔗糖合成酶SS1和糖轉(zhuǎn)運蛋白SlSWEET12c的表達(dá)量上調(diào),而其他糖代謝途徑基因的表達(dá)量均下調(diào)。以上結(jié)果說明,SlSWEETs基因被沉默以后,其介導(dǎo)的糖易化擴散活性會受到影響,引起果實中果糖和葡萄糖含量的增加,而對蔗糖含量影響不大。3.成功構(gòu)建了酵母缺陷型的表達(dá)載體pDR195-SlSWEET7a,-11b,-12c,-14,通過轉(zhuǎn)化酵母己糖缺陷型突變體EBY.VW4000,在不同碳源(麥芽糖、葡萄糖、果糖和半乳糖)的SD-ura選擇培養(yǎng)基中驗證了番茄果實中差異表達(dá)的4個SlSWEETs蛋白均具有轉(zhuǎn)運葡萄糖和果糖的特性,但對其他的己糖,如半乳糖并沒有表現(xiàn)出明顯的轉(zhuǎn)運能力。4.利用mbSUS基于泛素裂解的膜蛋白酵母雙雜系統(tǒng),分別將4個果實差異表達(dá)基因連入誘餌載體pMetYC_GW和捕獲載體p XN22_GW中,分別轉(zhuǎn)化到THY.AP4和THY.AP5酵母菌中,經(jīng)篩選培養(yǎng)基鑒定,在酵母二缺SD-Leu-Trp和三缺SD-Leu-Trp-His選擇培養(yǎng)基的嚴(yán)格篩選下,分別存在SlSWEET11b和SlSWEET14自激活形成同源二聚體,而SlSWEET7a/11b,SlSWEET11b/14,SlSWEET12c/11b,SlSWEET12c/14和SlSWEET14/11b(Nub-Cub)可以形成異源二聚體。5.利用BiFC雙分子熒光互補系統(tǒng)分別將SlSWEET7a、-11b、-12c和-14基因連入pXCGW和pXNGW載體,經(jīng)煙草葉片瞬時表達(dá)后發(fā)現(xiàn)SlSWEET11b和SlSWEET12c可以自激活形成同源二聚體,SlSWEET7a和SlSWEET14,以及SlSWEET11b和SlSWEET12c則可以互作形成異源二聚體。這說明具有單個7跨膜結(jié)構(gòu)域的SWEET蛋白分子并不足以在疏水性的質(zhì)膜上形成一個親水的通道讓葡萄糖等分子通過,這也為揭示小分子載體蛋白在行使功能時普遍具有多聚化現(xiàn)象及高等植物關(guān)于MtN3結(jié)構(gòu)域具有自身多聚化形成有功能的結(jié)構(gòu)提供了有力的實驗佐證。6.利用番茄果實圓片分別利用赤霉素(GA)、生長素(IAA)、脫落酸(ABA)和茉莉酸(MeJA)進(jìn)行處理,分別在處理8h和24h后,分析了4個果實差異表達(dá)SlSWEETs基因的表達(dá)及糖含量變化,結(jié)果表明,IAA、ABA和MeJA處理后,SlSWEET11b和SlSWEET14的表達(dá)量顯著上調(diào),尤其是ABA處理24h后SlSWEET14的表達(dá)量極顯著增加。SlSWEET14的啟動子中包含響應(yīng)MeJA的作用元件,但是并沒有響應(yīng)ABA的作用元件,說明可能有該途徑上的其他基因影響了其表達(dá)。孵育試驗明確了4個SlSWEETs基因可能參與了激素相關(guān)調(diào)節(jié)途徑來響應(yīng)生長素、脫落酸和茉莉酸的誘導(dǎo)。
【圖文】：

1981 在囊泡中純化的乳糖滲透酶催化糖的轉(zhuǎn)運和積累。1984 磷脂酰乙醇胺參與糖轉(zhuǎn)運所需的全部活動。1998 描述了半胱氨酸突變體；提出一種詳細(xì)的半乳糖/H+協(xié)同轉(zhuǎn)運機制。2003 報道了半乳糖滲透酶的晶體結(jié)構(gòu)。引自 Chen(Chen et aWinkler 和 Wilson(1966)研究發(fā)現(xiàn)乳糖透性酶的親和力對于流入和流出的乳糖，而對于 NPG (O-硝基苯-半乳糖苷)則相差 40 多倍，而 Vmax值沒有顯著不同在細(xì)胞中流出等于流入的固定狀態(tài)應(yīng)該達(dá)到相當(dāng)高的濃度。提出這種差異是由生的。Müller-Hill 實驗室首先成功克隆得到乳糖滲透酶基因(Bücheletal.,1980)。后來到其它主要家族的第一個糖轉(zhuǎn)運蛋白基因(Celenza et al., 1988;Hediger et al.,ckler et al., 1985; Newman et al., 1981; Riesmeier et al., 1992; Sauer and Tanner, 1，對糖轉(zhuǎn)運蛋白的研究進(jìn)入相對穩(wěn)定時期，直到 2010 年 SWEET 的克隆(Chen0)(圖 1-1)。

個關(guān)鍵的糖轉(zhuǎn)運蛋白被鑒定出來，包括己糖轉(zhuǎn)運蛋白 HXTs(Celenza et al.,轉(zhuǎn)運蛋白 GLUTs 和 Na+-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白 SGLTs(Hedigeretal.,1987)，運蛋白 STPs 和蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白 SUTs(圖 1-2)。除了 SGLTs 其他轉(zhuǎn)運蛋白超家族。而 SWEET 糖轉(zhuǎn)運蛋白廣泛存在于古生菌、植物以及人類之中，和 SGLT 轉(zhuǎn)運蛋白，它們通常只有 7 個跨膜結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞對糖的攝取和外排蛋白介導(dǎo)，這對糖在多細(xì)胞生物體內(nèi)不同細(xì)胞、組織和器官的分布有很重而，，真核生物的細(xì)胞高度分化，它們需要借助轉(zhuǎn)運蛋白通過這些間隔來攝因此，GLUTs、SWEETs、植物液泡葡萄糖運載體(vacuolar glucose transp)、早期響應(yīng)疏水轉(zhuǎn)運蛋白(early response to dehydration like transporters, ER膜單糖轉(zhuǎn)運蛋白(tonoplastmonosaccharidetransporters,TMTs)在糖轉(zhuǎn)運過程要的角色(Chen et al., 2015; Horiba et al., 2003; Sauer, N. et al., 1990)。轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運機制過異源表達(dá)系統(tǒng)分析、突變體分析、蛋白質(zhì)純化以及人工重構(gòu)合成蛋白質(zhì)質(zhì)的轉(zhuǎn)運活性、運輸方向進(jìn)行鑒定。如圖 1-2 所示糖轉(zhuǎn)運體的幾種主要轉(zhuǎn)運
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S641.2

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本文編號：2667823