【摘要】：水稻(Oryza sativa L.)是我國乃至全世界重要的糧食作物,其產(chǎn)量的高低一直成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。近年來,非生物脅迫日趨嚴(yán)重,嚴(yán)重影響植物的生長和產(chǎn)量。尋找、篩選和鑒定相關(guān)抗性基因,并利用基因工程手段進(jìn)行水稻抗逆育種是提高水稻抗逆和產(chǎn)量的重要手段。古菌生活于極端環(huán)境,蘊(yùn)含著許多水稻中不具有的包括耐高/低PH、高鹽度、高溫等基因,若能將這些珍貴的基因資源開發(fā)應(yīng)用到我國重要的糧食作物中,將會(huì)對農(nóng)作物的常規(guī)抗逆育種帶來革命性的突破。本實(shí)驗(yàn)前期,對嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌(古菌模式)進(jìn)行非生物脅迫(高溫、高鹽)處理后,通過對其蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ分析篩選出高表達(dá)的鐵氧還蛋白(ferredoixn,Fd)氨基酸序列。在本文中,我們利用基因合成的方法,獲得了水稻中高表達(dá)的MtFd基因,進(jìn)一步,構(gòu)建了水稻轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301-Mt Fd,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入水稻ZH11中,分析了MtFd轉(zhuǎn)基因水稻與野生型對照植株,正常生長條件下的光合特性和農(nóng)藝性狀的差異,及鹽、高溫、和低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因植株和野生型對照的光合效率。本文主要結(jié)果如下:1.MtFd過表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因水稻的獲得(1)根據(jù)嗜熱自養(yǎng)甲烷桿菌鐵氧還蛋白的氨基酸序列,通過對水稻偏愛密碼子分析,重新設(shè)計(jì)了MtFd DNA序列,交由公司進(jìn)行基因合成。利用轉(zhuǎn)基因載體pCAMBIA1301,成功構(gòu)建了水稻轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301-MtFd。(2)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,將pCAMBIA1301-MtFd轉(zhuǎn)化水稻中花11,通過潮霉素篩選和反轉(zhuǎn)錄PCR鑒定,獲得T_0代MtFd轉(zhuǎn)基因水稻植株18株。通過半定量PCR篩選出表達(dá)量較高的三個(gè)獨(dú)立株系(MtFd-1、MtFd-2、MtFd-5)進(jìn)行加代種植獲得T_1代植株。2.正常生長條件下,MtFd轉(zhuǎn)基因水稻植株光合特性的測定在自然氣溫下、上午9:00-11:00,利用Li-6400便攜式光合測定系統(tǒng)對抽穗期水稻劍葉分別測定凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、細(xì)胞間隙CO_2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)。結(jié)果表明:與野生型相比,轉(zhuǎn)基因株系Mt Fd-1、MtFd-2、MtFd-5凈光合速率(Pn)極顯著提高,分別提高51.2%、24.9%和31.2%,其中最大增加了59.97%(MtFd-1-3);而氣孔導(dǎo)度與光合作用速率呈現(xiàn)正比例的關(guān)系,增加幅度分別為60.5%、21.2%和28.8%;胞間CO_2和蒸騰速率均上升,但是上升的差異不顯著。這一結(jié)果表明,正常生長條件下,MtFd的異源表達(dá)提高了水稻的光合速率。3.MtFd轉(zhuǎn)基因水稻植株株高、粒長、粒寬、千粒重等農(nóng)藝性狀的測量利用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對T_1代表達(dá)量較高的三個(gè)獨(dú)立株系(MtFd-1、MtFd-2、Mt Fd-5)進(jìn)行株高、粒長、粒寬、千粒重等農(nóng)藝性狀的測量。結(jié)果顯示,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因植株的株高、粒寬和千粒重顯著下降,而粒長顯著增長。轉(zhuǎn)基因株系Mt Fd-1、MtFd-2、MtFd-5株高分別為野生型的86.9%、89.5%和90.4%;粒寬分別為野生型的89.3%、89.5%和91.9%;千粒重分別為野生型的84%、86.4%和90.9%;粒長分別增長了5%、5.9%和10.9%。4.MtFd轉(zhuǎn)基因水稻幼苗在非生物脅迫下光合特性的測定(1)低溫脅迫下MtFd轉(zhuǎn)基因水稻幼苗光合特性對生長至六葉期的水稻進(jìn)行低溫(8℃)脅迫,結(jié)果表明:在脅迫初期(0~2d)與正常生長條件相比,MtFd轉(zhuǎn)基因株系及野生型水稻的的凈光合速率(Pn)極顯著下降,ZH11、MtFd-1-2、MtFd-2-3、MtFd-5-1分別為正常生長條件下的11.8%、13.9%、21.9%、12.4%。相比野生型,轉(zhuǎn)基因株系Pn下降更快,且光合速率更低。同時(shí),與野生型相比,轉(zhuǎn)基因株系的氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和細(xì)胞間隙CO_2(Ci)與凈光合速率(Pn)的變化趨勢一致,均出現(xiàn)明顯的下降。在脅迫后期(2~4d)MtFd轉(zhuǎn)基因株系與野生型凈光合速率(Pn)略有回升,但不顯著。同時(shí),與野生型相比,轉(zhuǎn)基因株系的氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)和細(xì)胞間隙CO_2(Ci)與凈光合速率(Pn)的變化趨勢一致,都略有回升。(2)高溫脅迫下MtFd轉(zhuǎn)基因水稻幼苗光合特性對生長至六葉期的水稻進(jìn)行高溫(42℃)脅迫,結(jié)果表明:在脅迫初期(0~2d),與正常生長條件相比,MtFd轉(zhuǎn)基因株系及野生型水稻的的凈光合速率(Pn)極顯著下降,ZH11、Mt Fd-1-2、MtFd-2-3、MtFd-5-1分別為正常生長條件下的60.9%、68.3%、51.9%、59.4%。與野生型相比,轉(zhuǎn)基因株系下降較為迅速,但是Pn始終維持在較高水平。但是Pn下降的同時(shí)伴隨著Gs和Ci下降和Tr上升。在脅迫后期(2~4d),MtFd轉(zhuǎn)基因株系與野生型凈光合速率(Pn)略有回升,但不顯著。同時(shí)伴隨著Gs上升和Ci、Tr的下降,但是與處理第2天相比,變化趨勢均不顯著。(3)MtFd轉(zhuǎn)基因水稻幼苗鹽脅迫下光合特性對生長至六葉期的水稻進(jìn)行高鹽(150 mM)脅迫,結(jié)果表明:在脅迫初期(0~2d),與正常生長條件相比,MtFd轉(zhuǎn)基因株系及野生型水稻的的凈光合速率(Pn)極顯著下降,ZH11、Mt Fd-1-2、MtFd-2-3、MtFd-5-1分別為正常生長條件下的75.4%、65.7%、82.1%和64.9%。與野生型相比,轉(zhuǎn)基因株系下降較為迅速,但是Pn始終維持在較高水平。但是Pn下降的同時(shí)伴隨著Gs和Ci上升和Tr下降。在脅迫后期(2~4d),MtFd轉(zhuǎn)基因株系與野生型凈光合速率(Pn)持續(xù)下降,同時(shí)伴隨著Gs、Ci、Tr的下降。非生物脅迫下,Mt Fd轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的光合特性變化趨勢雖然與野生型植株相似,但變化響應(yīng)似乎更為迅速,這提示我們MtFd可能通過影響光合作用來提高植株對逆境脅迫的耐性
【圖文】：

硫鍵相互作用，如 AGPase，F(xiàn)BPase，SBPase 等與 Calvin 循環(huán)密切相關(guān)的酶。在葉中 Fd 主要向 FNR 提供電子用于接下來 NADPH 的還原最后在用于卡爾文循環(huán)[70, 71]。而根中恰恰與此相反，F(xiàn)d 需要 FNR 提供電子，如圖 1。圖 1 Fd 在根、葉中代謝途徑Fig.1 Metabolic pathways of Fd in roots and leaves我們參考 Mulo (2011)文獻(xiàn)和浙江大學(xué)楊超等人最新研究成果[72, 73]，來總結(jié)植物 Fd 在參與不同電子的調(diào)控途徑并對蛋白結(jié)構(gòu)、功能等進(jìn)行探討，，如圖 2。

第 1 章 前言生驅(qū)動(dòng) ATP 的 DpH 梯度通過 ATP 合成酶合成。在電子傳輸中鏈，PSI 將給予[2Fe-2S]結(jié)構(gòu) Fd[68]。電子通過光系統(tǒng)傳輸產(chǎn)生減少的 Fd。Fd 降低可一步與酶鐵氧還蛋白：硫氧還蛋白還原酶（FTR）相互作用并被氧化成氧化，而硫氧還蛋白（Trx）減少[69]。只要 Trx 減少，它就會(huì)與目標(biāo)酶上的特定二相互作用，如 AGPase，F(xiàn)BPase，SBPase 等與 Calvin 循環(huán)密切相關(guān)的酶。中 Fd 主要向 FNR 提供電子用于接下來 NADPH 的還原最后在用于卡爾文[70, 71]。而根中恰恰與此相反，F(xiàn)d 需要 FNR 提供電子，如圖 1。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S511

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 李林鋒;吳小鳳;劉素青;;湛江5種紅樹林樹種光合作用特性及光合固碳能力研究[J];廣西植物;2015年06期

2 楊超;胡紅濤;吳平;莫肖蓉;;高等植物鐵氧還蛋白-NADP~+氧化還原酶研究進(jìn)展[J];植物生理學(xué)報(bào);2014年09期

本文編號(hào)：2668162