【摘要】：Alport綜合征(Alport Syndrome,AS)是以眼、耳、腎病變?yōu)榕R床特征的先天/遺傳性腎臟病,是導致兒童終末期腎病(End-stage renal disease,ESRD)的主要原因之一。對兒童而言,AS由于起病隱匿,臨床表現(xiàn)多樣,病理表現(xiàn)不典型等特點極易誤診或漏診,基因診斷在AS早期診斷中具有重要價值。目前已發(fā)現(xiàn)COL4A5基因突變是X連鎖顯性遺傳型Alport綜合征(X-linked Alport Syndrome,XLAS)發(fā)病的主要原因,并且足細胞在疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,但是不同COL4A5基因突變對足細胞形態(tài)和功能的影響仍不明確。所以,本研究將對COL4A5基因突變的AS患兒臨床特征和基因突變的特點進行總結分析,以期減少臨床漏診的發(fā)生;同時從COL4A5基因突變對人足細胞功能影響入手,為AS的基因診斷及發(fā)病機制提供新的實驗依據(jù)。第一部分:COL4A5突變Alport綜合征兒童臨床表型分析目的:對COL4A5基因突變的XLAS患兒基因型和臨床表型進行總結,以期提高對Alport綜合征的認識。方法:回顧性分析2011年6月-2016年6月上海交通大學附屬兒童醫(yī)院(上海市兒童醫(yī)院)腎臟風濕科確診的COL4A5基因突變的XLAS 31例,通過收集臨床特征、實驗室檢查、病理診斷等資料,同時利用SPSS軟件對上述數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。結果:(1)31例COL4A5基因突變的XLAS患兒中女性12例(38.7%),男性19(61.2%)例,平均發(fā)病年齡2.6歲。臨床上以血尿蛋白尿為首發(fā)表現(xiàn)者男孩多于女孩,本組男性11例(11/19),女性僅2例(2/12)(P0.05)。而男性與女性患兒的發(fā)病年齡、陽性家族史、誘因及眼耳病變等差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。(2)26例在B超引導下行經(jīng)皮腎穿刺活檢檢查,腎組織病理光鏡提示20例表現(xiàn)為輕微病變,5例系膜增生,1例局灶節(jié)段性硬化;電鏡結果僅4例(26.7%)出現(xiàn)典型AS基底膜改變;IV型膠原α鏈熒光染色,60%患兒(共15例)α3、α5均陰性。(3)本組共檢出31種基因突變,其中19例錯義突變,2例大片段刪除,4例剪切位點突變,6例框移突變。19例錯義突變中16例突變?yōu)镚ly-X-Y型突變。31例患兒基因突變中發(fā)現(xiàn)新發(fā)突變11例,占35.4%。結論:兒童XLAS起病隱匿,多以血尿或血尿合并蛋白尿發(fā)病,臨床表型無明顯特異性,病理表現(xiàn)不典型(多為輕微病變),COL4A5基因突變以錯義突變最為多見,且新發(fā)突變率較高,給AS診斷造成困難,而基因檢測有助于提高AS的檢出率。第二部分:COL4A5基因突變對足細胞功能的影響通過第一部分的研究我們發(fā)現(xiàn),由于XLAS患兒發(fā)病時臨床表現(xiàn)無明顯特異性、病理組織形態(tài)不典型易造成臨床漏診,COL4A5基因突變檢測作為XLAS新的診斷標準之一,有助于提高AS的檢出率,但如何明確突變基因的致病性,也是困擾臨床醫(yī)師的熱點問題之一。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)800多種COL4A5基因突變,卻鮮有基因突變的功能驗證報道,為了進一步明確COL4A5基因突變的致病性及其對足細胞功能的影響,以有明確家族遺傳史患兒的COL4A5剪切突變c.232-1GA突變?yōu)槔?嘗試探討突變基因?qū)ψ慵毎禺愋苑肿蛹癐V型膠原蛋白表達的影響,為將來臨床上開展基因突變的驗證提供新的線索。目的:探討COLA45基因剪切位點突變c.232-1GA對足細胞IV型膠原表達和細胞功能的影響,從而為臨床診斷提供新的依據(jù),為疾病發(fā)生機制提供新的線索。方法:(1)實驗對象:人腎小球足細胞株,由Moin Saleem教授惠贈,實驗條件為37℃分化12-14天的足細胞,細胞鋪板為轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)。(2)實驗分組:隨機分為四組,空白對照組、空載體組、正常質(zhì)粒組和突變質(zhì)粒組。以pcDNA3.1為載體設計質(zhì)粒,COL4A5突變質(zhì)粒除c.232-1GA突變位點外,其余COL4A5基因序列皆與正常COL4A5質(zhì)粒相同。(3)實驗內(nèi)容:1)人腎小球足細胞培養(yǎng)及間接免疫熒光法鑒定足細胞表達nephrin和synaptopodin狀況。2)實時定量熒光PCR法及Western blot法分別檢測各組足細胞COL4A5/COL4A3/COL4A1 mRNA及蛋白表達水平。3)Western blot法檢測各組足細胞特異性分子podocin和α-actinin-4表達。(4)統(tǒng)計方法:應用SPSS統(tǒng)計軟件,所有計量資料均采用均數(shù)±標準差((?)±s)表示。組間兩兩比較,先檢驗數(shù)據(jù)均符合正太分布后采用單因素方差分析LSD方法分析,P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結果:(1)成功培養(yǎng)了人足細胞,且表達人足細胞特異性標志物(Nephrin、Synaptopodin)陽性。(2)COL4A5基因c.232-1GA突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后足細胞表達COL4A5蛋白及mRNA水平均明顯下降(與對照組相比,P值分別小于0.01和0.05)(Western blot、間接免疫熒光、qPCR);而對COL4A3、COL4A1的mRNA和蛋白表達水平無影響(P0.05)。(3)COL4A5基因c.232-1GA突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,足細胞表達podocin蛋白明顯降低(P0.05)(Western blot法),而不影響α-actinin-4的表達水平(P0.05)。結論:COL4A5基因c.232-1GA突變致足細胞COL4A5蛋白及隔膜裂孔蛋白podocin表達下調(diào),可能通過影響足細胞功能而致病,但確切機制有待闡明。
【圖文】：

為了明確 COL4A5 突變基因?qū)ψ慊純旱?COL4A5 剪切突變 c.232-1G子及 IV 型膠原蛋白的影響，為將來生后 1 年因尿頻就診，尿常規(guī)提示尿蛋白定性 2+-3+，24h 尿蛋白定血肌酐 19umol/L，泌尿系 B 超提示mHg，無眼部及耳部病變；家族中存在尿蛋白（++），潛血（++），功能異常。患兒于我院腎活檢，腎光 IV 型膠原 α1 鏈陽性，α3 鏈陰性

（7）將 DAPI 液滴在載玻片上，，用鑷子夾起小圓玻片蓋在滴有 DAPI 試劑的片上，靜置 30min。.7 統(tǒng)計學分析應用 SPSS 統(tǒng)計軟件分析，所有計量資料均采用均數(shù)±標準差（x±s）表示。兩兩比較，先檢驗數(shù)據(jù)均符合正太分布后采用單因素方差分析LSD方法分析，0.05 為差異顯著性，有統(tǒng)計學意義。結果 足細胞形態(tài)33℃培養(yǎng)條件下的足細胞，細胞體積較小，胞核位于細胞中央，細胞核呈圓足突細短；37℃條件下分化培養(yǎng) 12-14 天左右，足細胞分化成熟，細胞增大，變長向四周伸展，可見二級足突形成。（詳見圖 3-1）
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R726.9

【參考文獻】

相關期刊論文 前7條

1 柳珊珊;陳江華;;足細胞功能紊亂與微小病變性腎病[J];浙江大學學報(醫(yī)學版);2016年02期

2 孫蕾;匡新宇;郝勝;王平;鈕小玲;朱光華;周君梅;黃文彥;;Alport綜合征患兒臨床表型及基因型單中心分析[J];中華兒科雜志;2015年02期

3 宋瑩;麻宏偉;;X-連鎖低磷性佝僂病的診治進展[J];國際兒科學雜志;2015年01期

4 陳麗;薛俊芳;張琰琴;王芳;陳斯琦;段繼波;劉玉和;丁潔;;Alport綜合征的臨床聽力學特點分析[J];中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2014年11期

5 宋瑩;麻宏偉;黎芳;胡曼;任爽;宇亞芬;趙桂杰;;X-連鎖低磷性佝僂病的基因突變分析[J];中國當代兒科雜志;2013年11期

6 王夢婧;陳靖;;磷代謝與慢性腎臟病[J];腎臟病與透析腎移植雜志;2011年06期

7 丁潔;;Alport綜合征的診斷[J];腎臟病與透析腎移植雜志;2010年04期

相關博士學位論文 前1條

1 高暉;Alport綜合癥臨床病理分析及COL4A5基因突變的研究[D];中國醫(yī)科大學;2009年

本文編號：2666798