【摘要】：木聚糖酶是糖苷水解酶[EC 3.2.1.x]的一種,可以將木聚糖水解,生成木糖與低聚木糖。在果蔬加工、面制品加工、低聚木糖制備、造紙印染和動(dòng)物飼料的初級(jí)處理等行業(yè)中擁有應(yīng)用價(jià)值。由于木聚糖酶在很多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,高效的發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶對(duì)工業(yè)化具有實(shí)際意義。木聚糖酶基因的來(lái)源不同,其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)也有很大差別。本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)木聚糖酶的研究中,從鏈霉菌Streptomyces sp.FA1中得到了一種歸屬于糖苷水解酶第十家族的木聚糖酶(XynA)。將其在大腸桿菌中克隆,并進(jìn)行胞外表達(dá)。結(jié)果顯示有大量的包涵體存在。為了可以高效表達(dá)木聚糖酶,本課題在畢赤酵母(P.pastoris)中強(qiáng)化表達(dá)XynA,通過(guò)構(gòu)建游離型表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)與整合表達(dá)聯(lián)合應(yīng)用來(lái)強(qiáng)化XynA分泌效率,提高XynA酶活。主要結(jié)果如下:(1)通過(guò)PCR得到自主復(fù)制序列PARS1和PARS2,構(gòu)建了pMD18-T-PARS1、pMD18-T-PARS2,酶切驗(yàn)證并測(cè)序正確。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建pAOX1-PARS與pGAP-PARS系列游離型載體:pPICZαA-PARS1、pPICZαA-PARS2、pGAPZαA-PARS1、pGAPZαA-PARS2,酶切驗(yàn)證并測(cè)序正確。(2)將木聚糖酶基因整合到游離型質(zhì)粒,將游離重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)導(dǎo)入P.pastoris KM71,構(gòu)建游離型重組菌:P.pastoris KM71/pPICZαA-PARS1-xynA、P.pastoris KM71/pPICZαA-PARS2-xynA、P.pastoris KM71/pGAPZαA-PARS1-xynA、P.pastoris KM71/pGAPZαA-PARS2-xynA,分泌表達(dá)XynA。經(jīng)過(guò)搖瓶培養(yǎng)后,測(cè)定重組酶XynA的活力,篩選出最佳的游離型重組菌P.pastoris KM71/pGAPZαA-PARS2-xynA,木聚糖酶活最高達(dá)到29.6 U·m L-1。(3)對(duì)游離型重組菌在3.6 L罐水平進(jìn)行發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化,分別以甘油、葡萄糖、蔗糖、混合碳源(蔗糖:甘油=1:2)作為碳源優(yōu)化游離型重組菌株表達(dá)水平。以BSM培養(yǎng)基進(jìn)行上罐發(fā)酵,50%甘油為最適補(bǔ)料碳源,培養(yǎng)96 h后,最高酶活可達(dá)350 U·mL~(-1)。同整合型重組菌P.pastoris KM71/pGAPZαA-xynA相比,表達(dá)水平提高了45.9%。(4)在整合表達(dá)木聚糖酶的基礎(chǔ)上,將含有木聚糖酶基因的游離質(zhì)粒轉(zhuǎn)入菌株,構(gòu)建P.pastoris KM71/pPIC9K-xynA/pGAPZαA-xynA,實(shí)現(xiàn)雙啟動(dòng)子共表達(dá)(強(qiáng)化型)。通過(guò)搖瓶表達(dá),甲醇誘導(dǎo)144 h后,XynA酶活為202 U·mL~(-1),是單一整合型酶活的1.7倍。重組XynA發(fā)酵上清液,經(jīng)過(guò)40%(w/v)的(NH_4)_2SO_4沉淀、透析及Mono S陽(yáng)離子交換柱純化。對(duì)重組酶的酶學(xué)性質(zhì)定性,結(jié)果表明:木聚糖酶的最適溫度為60℃,55℃下120 h達(dá)到半衰期;最適pH為5.5,pH范圍3-11放置24 h,其酶活仍有80%左右;濃度為10 mmoL·L~-11 Fe~(3+)對(duì)XynA的活性有抑制作用,Mn~(2+)和Cr~(2+)對(duì)Xyn A保留約85%的活性。(5)在3.6 L罐上對(duì)強(qiáng)化型菌株進(jìn)行誘導(dǎo)溫度,初始誘導(dǎo)菌濃,甲醇誘導(dǎo)濃度三個(gè)方面優(yōu)化。最后得到最佳上罐條件為:在28℃,初始菌濃OD_(600)=100,甲醇的濃度為1.5%(v/v),誘導(dǎo)發(fā)酵144 h。XynA酶活達(dá)到3030 U·m L~(-1),是單一整合型的2.1倍同時(shí)強(qiáng)化型重組酶比活相對(duì)整合型表達(dá)提高了52.4%。為鏈霉菌來(lái)源的GH10家族木聚糖酶在畢赤酵母中表達(dá)的最高水平。
【圖文】：

糖酶聚糖簡(jiǎn)介是大自然中含有生物質(zhì)最豐富的，植物中含有豐富的木質(zhì)纖維素[1]。木質(zhì)纖，主要是由木質(zhì)素、纖維素、半纖維素等組成[2, 3]。半纖維素主要在植物的，半纖維素主要是單糖通過(guò)氫鍵、共價(jià)鍵等構(gòu)成的異質(zhì)多聚體，并與纖維聯(lián)，構(gòu)成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并有一定剛度與彈性的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[4]。常見(jiàn)的葡甘露聚糖、葡甘露聚糖等都屬于半纖維素[5]。其主鏈連接方式的不同，木聚糖劃分為兩大類(lèi)。第一類(lèi)是存在于陸生植物洋植物細(xì)胞壁中的 β-1,4-木聚糖；第二大類(lèi)：β-1,3-木聚糖，存在于某些海中[6, 7]。木糖單糖為一個(gè)單元，主鏈通過(guò) β-1,4-糖苷鍵連接形成木聚糖，阿其主鏈中的吡喃木糖取代[8]，木聚糖主要結(jié)構(gòu)如圖 1-1 所示[9]。木聚糖根據(jù)為兩類(lèi)，第一類(lèi)為硬木木聚糖，硬木木聚糖常在 D-木糖的 C-2 和 C-3 位上]。第二類(lèi)為軟木木聚糖，軟木木聚糖比硬木木聚糖分支少，，在 C-3 上連接喃糖[11]。木聚糖側(cè)鏈結(jié)構(gòu)和成分對(duì)木聚糖天然構(gòu)象、與其他多糖分子結(jié)合等理化特性具有一定影響[12]。

圖 1-2 甲醇代謝途徑Fig. 1-2 Methanol metabolism pathway1.2.2 畢赤酵母啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的起始是基因表達(dá)的關(guān)鍵因素，啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件，對(duì)于基因的表達(dá)水平有著重要的影響，直接影響轉(zhuǎn)錄的效率[58]。在畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的系統(tǒng)中，啟動(dòng)子資源相當(dāng)豐富[59-61]。啟動(dòng)子的選擇，對(duì)外源蛋白的表達(dá)影響很大。在畢赤酵母系統(tǒng)中表達(dá)外源蛋白的種類(lèi)、大小都不盡相同，為了可以高效順利的表達(dá)蛋白，選擇合適的啟動(dòng)子至關(guān)重要。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的啟動(dòng)子主要分為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與組成型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有著嚴(yán)格的調(diào)控基因，只有在特定的誘導(dǎo)劑下，才可以啟動(dòng)，如 AOX1、FLD1。這類(lèi)啟動(dòng)子有許多優(yōu)點(diǎn)，最主要的的是它對(duì)于表達(dá)外源蛋白與菌體生長(zhǎng)是非偶聯(lián)狀態(tài)。菌體生長(zhǎng)并不產(chǎn)酶，不會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)造成壓力，同時(shí)切換成誘導(dǎo)劑，前期生物量的積累對(duì)后期產(chǎn)酶以及誘導(dǎo)劑毒性對(duì)量的影響有一定的幫助。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子雖然有很多優(yōu)點(diǎn)，但是對(duì)其誘導(dǎo)劑的專(zhuān)一性在實(shí)際生產(chǎn)中也受到了限
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：TQ920.1;Q78

【參考文獻(xiàn)】

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3 許正宏,熊筱晶,陶文沂;低聚木糖的生產(chǎn)及應(yīng)用研究進(jìn)展[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2002年01期

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本文編號(hào)：2666727