【摘要】：生菜(Lactuca sativa)是世界上最重要的蔬菜之一。紅色生菜由于其色澤及其健康保健功能,逐漸受到更多消費(fèi)者的青睞。生菜葉片的紅色主要是由花青素類物質(zhì)在葉表皮細(xì)胞積累形成。葉片顏色是生菜的重要農(nóng)藝性狀之一,產(chǎn)生顏色的花青素有抗氧化能力,具有抗癌抗衰老的作用。然而到目前為止關(guān)于生菜葉片顏色的相關(guān)研究仍然較少。本實(shí)驗(yàn)利用紅色生菜和綠色油麥菜進(jìn)行雜交,構(gòu)建F2葉色分離群體,通過傳統(tǒng)遺傳學(xué)和第二代測序技術(shù)相結(jié)合的方法,精細(xì)定位并克隆了3個(gè)控制生菜紅色葉片性狀的基因(Red Lettuce Leaves 1-3,RLL1-3),并系統(tǒng)分析它們的作用機(jī)理,為進(jìn)一步了解花青素的合成與調(diào)控以及培育高花青素含量的生菜品種奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1.紅色生菜親本S1與綠色油麥菜親本Y37雜交后自交得到F2分離群體,表型分析以及混合池(BSA)+RNA-Seq分析均表明該群體的葉色由多個(gè)質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀控制。在候選區(qū)域開發(fā)分子標(biāo)記掃描F2群體,最后鎖定5號染色體存在兩個(gè)主效基因位點(diǎn),命名為RLL1和RLL2。2.為了將多基因性狀進(jìn)行單基因化,在RLL1和RLL2候選區(qū)域開發(fā)分子標(biāo)記,從F2群體中挑選RLL1區(qū)域?yàn)殡s合,RLL2區(qū)域?yàn)轱@性純合的植株自交得到RLL1的單基因分離F2:3群體;用同樣方法獲得RLL2的單基因分離群體。3.用BSA+RNA-Seq方法對RLL1單基因分離群體進(jìn)行驗(yàn)證,然后擴(kuò)大經(jīng)驗(yàn)證的群體,并從6,851株植株中挑出1,751株隱性植株作為精細(xì)定位群體。利用該群體將RLL1位點(diǎn)定位在生菜第5號染色體404.3-407.2 Mb之間,并最終成功克隆了RLL1基因。RLL1編碼一個(gè)b HLH轉(zhuǎn)錄因子,該基因在綠色親本中有一個(gè)5 bp的缺失突變,導(dǎo)致其功能缺失。轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證了該基因的功能。該基因調(diào)控多個(gè)花青素合成途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),酵母單雜交顯示其編碼蛋白與DFR和ANS的啟動子順式元件結(jié)合。4.種植RLL2單基因分離群體共5,430株,并以其中的1,372株隱性植株作為精細(xì)定位群體,用上述方法將RLL2基因定位在5號染色體的一個(gè)未組裝區(qū)域(gap)。通過分析該群體兩個(gè)混合池之間所有SNP頻率差異,發(fā)現(xiàn)生菜未組裝的一個(gè)scaffold與RLL2共分離,該scaffold上一個(gè)編碼R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因選定為RLL2候選基因。該基因在紫色親本中存在,并高量表達(dá),但在綠色親本中缺失,呈現(xiàn)有無多態(tài)性。將該基因轉(zhuǎn)入單基因分離群體中的綠色植株導(dǎo)致葉色轉(zhuǎn)為紅色。RLL2蛋白結(jié)合花青素合成途徑結(jié)構(gòu)基因DFR和ANS的啟動子順式元件。5.在精細(xì)定位RLL2的過程中發(fā)現(xiàn)RLL3位點(diǎn)。RLL3是花青素合成的負(fù)調(diào)控因子,通過F3:4亞群體進(jìn)行精細(xì)定位,最終成功克隆了RLL3。RLL3編碼一個(gè)R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子,酵母雙雜交等實(shí)驗(yàn)表明RLL3是通過與R2R3-MYB競爭結(jié)合b HLH轉(zhuǎn)錄因子來抑制花青素的合成。6.RLL1-3基因進(jìn)化分析。從栽培和野生生菜中PCR擴(kuò)增RLL1和RLL3基因序列并進(jìn)行進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因的功能變化都發(fā)生在馴化后。RLL1的突變使植株失去合成花青素的能力,植株變成綠色;RLL3的突變使植株表現(xiàn)的紅色更深。在馴化過程中,生菜葉片色澤向兩個(gè)極端方向進(jìn)行,呈現(xiàn)典型的歧化選擇(disruptive selection)模式。本研究克隆的3個(gè)控制生菜葉色的基因可直接應(yīng)用于生菜的育種。同時(shí)對3個(gè)基因的分子作用機(jī)理的解析豐富了植物花青素代謝調(diào)控的研究。本研究為進(jìn)化學(xué)提供一個(gè)典型的歧化選擇例子。
【圖文】：

圖 1 花青素生物合成途徑(Petroni and Tonelli, 2011)Fig. 1 Anthocyanin biosynthesis pathway (Petroni and Tonelli, 2011)1.1.3 花青素的表達(dá)調(diào)控雖然包括花青素在內(nèi)的類黃酮物質(zhì)都是經(jīng)過同一條生物合成途徑生成的，但是在植物各種組織和器官中的積累都依據(jù)不同的生長階段和環(huán)境條件而各不相同，從而行使各種各樣的生物學(xué)功能�；ㄇ嗨氐暮铣缮婕傲硕鄠�(gè)結(jié)構(gòu)基因，因此對其精準(zhǔn)的時(shí)空表達(dá)調(diào)控，需要一套特殊的轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)來完成。近十多年來，越來越多的研究表明，花青素種類和含量的變化主要受到 MYB、bHLH 和 WD40 這三種轉(zhuǎn)錄因子組成的 MBW 復(fù)合體的調(diào)控(Ramsay and Glover, 2005; Davies et al., 2012; Xu et al.,2015; Zhu et al., 2017a)。MBW 是高度組織化的復(fù)合體，每個(gè)亞單位都具有特定的功能，例如 MYB/bHLH 與 DNA 結(jié)合，激活目標(biāo)基因的表達(dá)，而 WD40 穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等。

中間的那個(gè) G 堿基，而 His/Lys9 則結(jié)合最后的 G 堿基(Massari and Murre, 2000Toledo-Ortiz et al., 2003; Li et al., 2006)。bHLH 結(jié)構(gòu)域中的α-螺旋是由異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸組成的，其主要功能是形成異源二聚體或者同源二聚體。這些氨基酸在擬南芥的所有 bHLH 蛋白中都高度保守，說明它們對于正常行使功能十分重要。在兩個(gè) bHLH 轉(zhuǎn)錄因子形成二聚體的過程中，它們的堿性區(qū)會分別結(jié)合到 DNA 其中一條鏈上的目標(biāo)順式元件上，缺一不可(Ellenberger et al., 1994; Shimizu et al., 1997; Massari and Murre, 2000; Heim eal., 2003; Toledo-Ortiz et al., 2003)。在兩個(gè)α-螺旋之間存在一個(gè)序列多樣化的環(huán)狀區(qū)它不僅能將兩個(gè)α-螺旋分隔開，，而且還有助于α-螺旋在三維結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定。環(huán)狀區(qū)能夠識別并結(jié)合 G-box 附近的堿基，增加 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子對 DNA 的特異性識別能力(Ferre-D'Amare et al., 1993; Ellenberger et al., 1994; Toledo-Ortiz et al., 2003; Li eal., 2006)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S636.2

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本文編號：2666815