【摘要】：生菜(Lactuca sativa)是世界上最重要的蔬菜之一。紅色生菜由于其色澤及其健康保健功能,逐漸受到更多消費者的青睞。生菜葉片的紅色主要是由花青素類物質在葉表皮細胞積累形成。葉片顏色是生菜的重要農(nóng)藝性狀之一,產(chǎn)生顏色的花青素有抗氧化能力,具有抗癌抗衰老的作用。然而到目前為止關于生菜葉片顏色的相關研究仍然較少。本實驗利用紅色生菜和綠色油麥菜進行雜交,構建F2葉色分離群體,通過傳統(tǒng)遺傳學和第二代測序技術相結合的方法,精細定位并克隆了3個控制生菜紅色葉片性狀的基因(Red Lettuce Leaves 1-3,RLL1-3),并系統(tǒng)分析它們的作用機理,為進一步了解花青素的合成與調控以及培育高花青素含量的生菜品種奠定基礎。主要結果如下:1.紅色生菜親本S1與綠色油麥菜親本Y37雜交后自交得到F2分離群體,表型分析以及混合池(BSA)+RNA-Seq分析均表明該群體的葉色由多個質量性狀和數(shù)量性狀控制。在候選區(qū)域開發(fā)分子標記掃描F2群體,最后鎖定5號染色體存在兩個主效基因位點,命名為RLL1和RLL2。2.為了將多基因性狀進行單基因化,在RLL1和RLL2候選區(qū)域開發(fā)分子標記,從F2群體中挑選RLL1區(qū)域為雜合,RLL2區(qū)域為顯性純合的植株自交得到RLL1的單基因分離F2:3群體;用同樣方法獲得RLL2的單基因分離群體。3.用BSA+RNA-Seq方法對RLL1單基因分離群體進行驗證,然后擴大經(jīng)驗證的群體,并從6,851株植株中挑出1,751株隱性植株作為精細定位群體。利用該群體將RLL1位點定位在生菜第5號染色體404.3-407.2 Mb之間,并最終成功克隆了RLL1基因。RLL1編碼一個b HLH轉錄因子,該基因在綠色親本中有一個5 bp的缺失突變,導致其功能缺失。轉基因驗證了該基因的功能。該基因調控多個花青素合成途徑結構基因的表達,酵母單雜交顯示其編碼蛋白與DFR和ANS的啟動子順式元件結合。4.種植RLL2單基因分離群體共5,430株,并以其中的1,372株隱性植株作為精細定位群體,用上述方法將RLL2基因定位在5號染色體的一個未組裝區(qū)域(gap)。通過分析該群體兩個混合池之間所有SNP頻率差異,發(fā)現(xiàn)生菜未組裝的一個scaffold與RLL2共分離,該scaffold上一個編碼R2R3-MYB轉錄因子的基因選定為RLL2候選基因。該基因在紫色親本中存在,并高量表達,但在綠色親本中缺失,呈現(xiàn)有無多態(tài)性。將該基因轉入單基因分離群體中的綠色植株導致葉色轉為紅色。RLL2蛋白結合花青素合成途徑結構基因DFR和ANS的啟動子順式元件。5.在精細定位RLL2的過程中發(fā)現(xiàn)RLL3位點。RLL3是花青素合成的負調控因子,通過F3:4亞群體進行精細定位,最終成功克隆了RLL3。RLL3編碼一個R3-MYB轉錄因子,酵母雙雜交等實驗表明RLL3是通過與R2R3-MYB競爭結合b HLH轉錄因子來抑制花青素的合成。6.RLL1-3基因進化分析。從栽培和野生生菜中PCR擴增RLL1和RLL3基因序列并進行進化分析,發(fā)現(xiàn)兩個基因的功能變化都發(fā)生在馴化后。RLL1的突變使植株失去合成花青素的能力,植株變成綠色;RLL3的突變使植株表現(xiàn)的紅色更深。在馴化過程中,生菜葉片色澤向兩個極端方向進行,呈現(xiàn)典型的歧化選擇(disruptive selection)模式。本研究克隆的3個控制生菜葉色的基因可直接應用于生菜的育種。同時對3個基因的分子作用機理的解析豐富了植物花青素代謝調控的研究。本研究為進化學提供一個典型的歧化選擇例子。
【圖文】：

圖 1 花青素生物合成途徑(Petroni and Tonelli, 2011)Fig. 1 Anthocyanin biosynthesis pathway (Petroni and Tonelli, 2011)1.1.3 花青素的表達調控雖然包括花青素在內(nèi)的類黃酮物質都是經(jīng)過同一條生物合成途徑生成的，但是在植物各種組織和器官中的積累都依據(jù)不同的生長階段和環(huán)境條件而各不相同，從而行使各種各樣的生物學功能�；ㄇ嗨氐暮铣缮婕傲硕鄠�結構基因，因此對其精準的時空表達調控，需要一套特殊的轉錄因子系統(tǒng)來完成。近十多年來，越來越多的研究表明，花青素種類和含量的變化主要受到 MYB、bHLH 和 WD40 這三種轉錄因子組成的 MBW 復合體的調控(Ramsay and Glover, 2005; Davies et al., 2012; Xu et al.,2015; Zhu et al., 2017a)。MBW 是高度組織化的復合體，每個亞單位都具有特定的功能，例如 MYB/bHLH 與 DNA 結合，激活目標基因的表達，而 WD40 穩(wěn)定轉錄因子復合體等。

中間的那個 G 堿基，而 His/Lys9 則結合最后的 G 堿基(Massari and Murre, 2000Toledo-Ortiz et al., 2003; Li et al., 2006)。bHLH 結構域中的α-螺旋是由異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸組成的，其主要功能是形成異源二聚體或者同源二聚體。這些氨基酸在擬南芥的所有 bHLH 蛋白中都高度保守，說明它們對于正常行使功能十分重要。在兩個 bHLH 轉錄因子形成二聚體的過程中，它們的堿性區(qū)會分別結合到 DNA 其中一條鏈上的目標順式元件上，缺一不可(Ellenberger et al., 1994; Shimizu et al., 1997; Massari and Murre, 2000; Heim eal., 2003; Toledo-Ortiz et al., 2003)。在兩個α-螺旋之間存在一個序列多樣化的環(huán)狀區(qū)它不僅能將兩個α-螺旋分隔開，，而且還有助于α-螺旋在三維結構上的穩(wěn)定。環(huán)狀區(qū)能夠識別并結合 G-box 附近的堿基，增加 bHLH 轉錄因子對 DNA 的特異性識別能力(Ferre-D'Amare et al., 1993; Ellenberger et al., 1994; Toledo-Ortiz et al., 2003; Li eal., 2006)。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S636.2

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本文編號：2666815