【摘要】：目的:探討沉默eIF4A1基因對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的生物學行為和胃癌裸鼠移植瘤模型的影響及其可能作用機制。方法:在37℃、5%CO_2細胞培養(yǎng)箱中,用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人胃癌SGC-7901細胞。取對數生長期胃癌SGC-7901細胞每孔3.5×10~5個接種于6孔板。當細胞融合度達到40%-60%時,按轉染說明書步驟,分別將eIF4A1基因沉默重組慢病毒顆粒LV-EIF4A1-RNAi(44682-1)、LV-EIF4A1-RNAi(44683-1)、LV-EIF4A1-RNAi(44684-1)和對照慢病毒顆粒CON077分別感染人胃癌SGC-7901細胞,分別標記為沉默組(eIF4A1-RNAi)(2、3、4)和陰性對照組(CON077),另外設立一組未做任何處理的SGC-7901胃癌細胞作為空白對照組(control)。轉染后,用嘌呤霉素篩轉染細胞并選出穩(wěn)定轉染株。用實時熒光定量PCR檢測各組人胃癌SGC-7901細胞eIF4A1基因的相對表達量,篩選出eIF4A1表達量最低為實驗所用的沉默組(eIF4A1-RNAi),并檢測該沉默組(eIF4A1-RNAi)與陰性對照組(CON077)和空白對照組(control)的AKT基因的相對表達量。用CCK-8法檢測初始樣本量為4×10~3個的各組人胃癌SGC-7901細胞的增殖能力;用流式細胞儀檢測各組人胃癌SGC-7901細胞5×10~6個細胞的凋亡情況和1×10~6個細胞的周期分布;用Transwell實驗分別檢測各組人胃癌SGC-7901細胞遷移和侵襲能力;Western blot檢測各組細胞eIF4A1和AKT的蛋白表達水平。取4周齡裸鼠24只,隨機分成3組。取對數生長期的各組人胃癌SGC-7901細胞,調整細胞濃度為1.5×10~6個/ml,分別于每只裸鼠的左上肢腋窩下接種200ul。常規(guī)飼養(yǎng),每天觀察并記錄裸鼠精神、營養(yǎng)等狀態(tài),成瘤后隔三天測量記錄瘤體體積。21天后用頸椎脫臼法處死各組裸鼠,取出各組裸鼠的皮下瘤、肝臟、肺臟組織并浸泡于10%福爾馬林中,24小時后做成蠟塊組織。把各組裸鼠的皮下瘤、肝臟、肺臟蠟塊組織切片,HE染色后,觀察其組織的病理改變。把取各組裸鼠的皮下瘤蠟塊組織切片,用免疫組織化學檢測方法,檢測各組裸鼠組織切片的eIF4A1蛋白表達。結果:實時熒光定量PCR檢測顯示LV-EIF4A1-RNAi(44683-1)組eIF4A1基因的相對表達量最低為0.31±0.04,低于空白對照組(control)的表達量的0.5倍,符合實驗要求,選擇該組為eIF4A1沉默組(eIF4A1-RNAi);CCK-8實驗檢測發(fā)現沉默組(eIF4A1-RNAi)細胞增殖活力明顯低于陰性對照組(CON077)組和空白對照組(control);流式細胞儀檢測發(fā)現沉默組(eIF4A1-RNAi)細胞凋亡率明顯比陰性對照組(CON077)和空白對照組(control)高,并且沉默組(eIF4A1-RNAi)與陰性對照組(CON077)和空白對照組(control)比較,細胞更多處于S期,G_1/G_2期細胞則相對減少;Transwell實驗發(fā)現較陰性對照組(CON077)和空白對照組(control),沉默組(eIF4A1-RNAi)細胞的遷移、侵襲能力下降;Western blotting檢測發(fā)現,較陰性對照組(CON077)和空白對照組(control),沉默組(eIF4A1-RNAi)的eIF4A1和AKT基因的蛋白表達明顯降低;構建裸鼠皮下瘤模型,發(fā)現較陰性對照組(CON077)和空白對照組(control),沉默組(eIF4A1-RNAi)裸鼠皮下瘤增長速度明顯減慢;免疫組化實驗顯示,較陰性對照組(CON077)和空白對照組(control),沉默組(eIF4A1-RNAi)eIF4A1和AKT的表達量明顯降低。CON077組與control組比較,上述指標差異均無統計學意義(P0.05)。結論:沉默eIF4A1基因能提高人胃癌SGC-7901細胞凋亡率,抑制增殖、遷移和侵襲能力、使細胞周期阻滯于S期,沉默eIF4A1基因能夠抑制人胃癌裸鼠皮下瘤模型腫瘤的生長速度,其機制可能與eIF4A1抑制AKT的表達量相關。
【圖文】：

首先于普通光鏡下觀察細胞的數量及分布情況，并進行拍照錄。調換為熒光模式并進行曝光時間及燈光亮度的調節(jié)，當視野達到最晰后，，觀察熒光細胞的數量及分布情況，然后在與普通光鏡相同視野下行拍照記錄。用顯微鏡自帶的軟件將兩張照片融合在一起，以此來比較視野下的細胞熒光率。移動六孔板，并在不同視野下拍照對比，并對病轉染細胞的效率進行初步的評估，并做好記錄（見圖 1）。對轉然后細胞反復多次觀察，并拍照融合對比各組細胞的熒光率后，發(fā)現沉默組eIF4A1-RNAi2）、沉默組（eIF4A1-RNAi3）、沉默組（eIF4A1-RNAi4性對照組（CON077）轉染效率都在 85%以上，因此說明此次病毒轉染細實驗成功，轉染后的細胞可以用來進行后續(xù)的實驗。

圖 2 各組胃癌 SGC-7901 細胞的細胞活力的變化Figure 2 Changes in cell viability of gastric cancer SGC-7901 cells in each grou4 沉默 eIF4A1 基因對人胃癌 SGC-7901 細胞周期的影響用流式細胞儀檢測各組細胞周期結果顯示各組細胞周期（G1占比分別為：eIF4A1-RNAi 組（52.07±0.73、15.00±0.76、32.93±0.25）組（56.28±0.53、7.67±0.44、36.05±0.86）、control 組（56.68±1.87、735.44±1.39）。與 CON077 組和 control 組比較，可見下調 eIF4AeIF4A1-RNAi 組細胞處在于 S 期比例增加，而處在 G1、G2的細胞所降低，差異均有統計學意義(P ＜0.05（)見圖 3）。而 CON077 組組比較差異無統計學意義（P＞0.05)。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2

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1 謝東毅;沉默eIF4Al基因對體內外胃癌SGC-7901細胞的影響及其機制探討[D];廣西醫(yī)科大學;2018年

本文編號：2663628