【摘要】：基因組DNA包含了細(xì)胞的絕大部分遺傳信息,在真核生物細(xì)胞中,DNA纏繞在組蛋白八聚體上形成核小體,核小體進(jìn)一步凝聚成染色質(zhì)。DNA和組蛋白上的共價(jià)修飾也會(huì)影響相應(yīng)區(qū)段基因的轉(zhuǎn)錄,構(gòu)成了DNA序列以外影響基因表達(dá)的另外一層信息。水稻基因組的重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座子元件占基因組的40%左右,并且很多轉(zhuǎn)座子序列與基因相鄰,而DNA甲基化主要發(fā)生在重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座子元件上,所有水稻中DNA甲基化對調(diào)控基因表達(dá)和生長發(fā)育非常重要。本博士論文詳細(xì)地分析了水稻幼苗組織中基因組DNA甲基化圖譜,研究了水稻染色質(zhì)變構(gòu)因子DDM1在維持基因組DNA甲基化中的功能以及調(diào)控水稻基因表達(dá)及生長發(fā)育的機(jī)制。水稻中有兩個(gè)DDM1的同源基因OsDDM1a和OsDDM1b,它們的蛋白質(zhì)序列和CDS的一致性都非常高。我們得到兩個(gè)基因的單突變體,并將osddm1a和osddm1b突變體雜交得到osddm1a/1b雙突變體,與野生型相比單突變體沒有明顯表型變異,雙突變體表型為植株變小,株高只有野生型的1/4左右,且雌雄不育,不能結(jié)實(shí)。對突變體和野生型發(fā)芽12天的葉片進(jìn)行全基因組甲基化測序發(fā)現(xiàn),osddm1a和osddm1b突變體DNA甲基化水平分別降低9.7%和16.5%,而雙突變體總體甲基化降低了54%,其中CG、CHG和CHH(H=A、T和C)甲基化水平分別降低44.9%、73.5%和49.1%。水稻基因組中CG和CHG甲基化主要分布在染色體著絲粒及周邊區(qū)域(異染色質(zhì)區(qū)域),CHH甲基化則在常染色質(zhì)有更多的富集。非轉(zhuǎn)座子基因的gene body及其3’-UTR和5’-UTR都有較高的CG序列甲基化,CHG和CHH序列甲基化主要分布在3’-UTR和5’-UTR,在osddm1a/1b雙突變體中,基因中的CG、CHG和CHH序列的DNA甲基化都明顯降低。轉(zhuǎn)座子相關(guān)基因(TEGs)和轉(zhuǎn)座子序列上有非常高的CG(80%)和CHG(80%左右)甲基化,在osddm1a/1b雙突變體中CG(40%左右)和CHG(20%)甲基化降低非常顯著。在osddm1a/1b雙突變體中,小轉(zhuǎn)座子上CHH甲基化降低,而長的轉(zhuǎn)座子上CHH甲基化增加。OsDRM2是CHH序列甲基轉(zhuǎn)移酶,突變后導(dǎo)致全基因組CHH甲基化降低。比較兩個(gè)突變體CHH甲基化的變化,發(fā)現(xiàn)常染色質(zhì)CHH甲基化在osddm1a/1b雙突變體和osdrm2突變體中都降低,osddm1a/1b雙突變體中CHH序列甲基化降低的位點(diǎn)與osdrm2突變體CHH序列甲基化降低的位點(diǎn)完全重合,說明OsDDM1和OsDRM2共同參與常染色質(zhì)CHH甲基化的維持。我們對野生型和osddm1a/1b雙突變體發(fā)芽12天的葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq),研究DNA甲基化缺失對基因表達(dá)的影響。RNA-seq數(shù)據(jù)分析表明雙突變體中表達(dá)上升4倍的基因有1453個(gè),表達(dá)下調(diào)的有141個(gè)。表達(dá)上調(diào)的基因中有60%(859/1453)的基因?qū)儆赥EGs,其中80.3%(687/859)的TEGs和34%(200/594)的非轉(zhuǎn)座子基因CHG甲基化水平非常顯著降低,表達(dá)上調(diào)非轉(zhuǎn)座子基因有較高的H3K9me2修飾。說明OsDDM1主要通過維持CHG甲基化抑制轉(zhuǎn)座子基因以及異染色質(zhì)非轉(zhuǎn)座子基因的表達(dá)。osddm1a/1b雙突變體中著絲粒區(qū)域和一些長的轉(zhuǎn)座子上的CHH序列甲基化增加,說明OsDDM1抑制異染色質(zhì)CHH甲基化。RNA介導(dǎo)的DNA甲基化途徑(RdDM)參與CHH甲基化的起始和維持,sRNA在RNA介導(dǎo)的DNA甲基化途徑中非常重要。我們對突變體和野生型材料進(jìn)行sRNA測序(sRNA-seq),分析osddm1a/1b雙突變體中CHH甲基化的變化和sRNA的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)osddm1a/1b雙突變體中CHH甲基化的變化和24nt siRNA變化呈正相關(guān)的關(guān)系,osddm1a/1b突變體中CHH甲基化的變化與RdDM相關(guān)的。我們構(gòu)建OsDDM1和RdDM途徑的CHH甲基轉(zhuǎn)移酶OsDRM2的突變體,對osddm1a/1b/drm2三突變體進(jìn)行全基因組亞硫酸鹽測序,分析發(fā)現(xiàn)三突變體中基因組總體DNA甲基化以及CG、CHG甲基化相對于osddm1a/1b有更加明顯的降低,并且osddm1a/1b雙突變體中增加的CHH甲基化在三突變體中也降低了,說明RdDM介導(dǎo)了osddm1a/1b中CHH甲基化的增加,OsDDM1和OsDRM2共同維持基因組的DNA甲基化。
【圖文】：

圖 1 基因表達(dá)的主要表觀調(diào)控機(jī)制(Rajender et al 2011)Fig.1 Major epigenetic regulation mechanisms of gene expression.2.2.1 DNA 甲基化高等生物的 DNA 甲基化主要發(fā)生胞嘧啶第五位碳原子上。哺乳動(dòng)物的 DNA 化主要發(fā)生在對稱的 CG 序列上，基因組中大約 70%-80%的 CG 序列是甲基化的而少量非 CG 序列的 DNA 甲基化存在胚胎干細(xì)胞中，非甲基化 CG 序列主要分基因啟動(dòng)子附近的 CG 島(Law and Jacobsen 2010) 。植物 DNA 甲基化的分布與存在明顯差異，植物 DNA 甲基化發(fā)生在胞嘧啶的三種序列上：對稱的 CG 和 CH列和非對稱的 CHH 序列（H=A、T 和 C）(Henderson and Jacobsen 2007)。且 DN基化主要分布在轉(zhuǎn)座元件和重復(fù)序列上(Zhang et al 2006)。由于不同物種基因組復(fù)序列和轉(zhuǎn)座子元件的比例不一樣，它們的 DNA 甲基化水平是不一樣的。擬

它的 CG、CHG、CHH 甲基化水平分別 39.9%、23.7%、4.7% (Hu et al 2014)。水稻基因組的 DNA 甲基化水平比擬南芥高很多，但低于玉米，這也與三個(gè)物種基因組中重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座元件的比例是相符合的。研究表明植物 CG、CHG、CHH 三種序列的 DNA 甲基化是由不同的 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶催化維持的。植物中 CG 序列甲基化通過 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 MET1（METHYLTRANSFERASE 1）維持，它與哺乳動(dòng)物中的 DNMT1 同源；CHG 序列甲基化是通過植物特有的 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 CMT3（CHROMOMETHYLASE 3）維持 ； DRM2(DOMAINS REARRANGED METHYLTRANSFERASSE 2) 和 CMT2（CHROMOMETHYLASE 2）共同維持 CHH 甲基化，DRM2 在哺乳動(dòng)物同源基因?yàn)?DNMT3，參與 RNA 介導(dǎo)的 DNA 甲基化途徑（RdDM）負(fù)責(zé)甲基化的起始。(Chanet al 2005; Law and Jacobsen 2010; Yang et al 2017; Zemach et al 2013) （圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S511

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本文編號：2663706