【摘要】：酪氨酸酶基因(Tyrosinase,TYR)、β-防御素103基因(Defensin beta 103B,CBD103)及小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Microphthalmia-associtated transcription factor,MITF)是調(diào)控動物被毛顏色的主效基因。多彩的毛色不僅對于動物自身趨利避害、相互識別和求偶等方面有重要的作用,同時(shí)對于毛皮產(chǎn)品的生產(chǎn)和加工及其經(jīng)濟(jì)價(jià)值有重要影響。在基因表達(dá)調(diào)控中,啟動子不僅能決定基因轉(zhuǎn)錄起始,還能調(diào)控基因表達(dá)的強(qiáng)弱,但在狐貍的相關(guān)研究中鮮有報(bào)道。因此,本研究利用生物信息學(xué)方法、分子克隆、細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)及點(diǎn)突變技術(shù)對影響北極狐毛色形成的TYR、CBD103和MITF基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行研究。研究結(jié)果為揭示各基因調(diào)控北極狐被毛顏色分子遺傳機(jī)制提供理論依據(jù),同時(shí)對于揭示北極狐被毛顏色的遺傳多樣性有重要意義。本研究利用生物信息學(xué)方法結(jié)合PCR克隆技術(shù)首次獲得北極狐CBD103、MITF-M和TYR基因5′側(cè)翼區(qū)及全部編碼區(qū)序列。擴(kuò)增獲得:CBD103基因2 327bp(5′側(cè)翼區(qū)2 071 bp、CDS區(qū)204 bp、3′側(cè)翼區(qū)52 bp);MITF-M基因3 880bp(5′側(cè)翼區(qū)2 262 bp、CDS區(qū)1 260 bp、3′側(cè)翼區(qū)358 bp);TYR基因4 300bp(5′側(cè)翼區(qū)2 681 bp、CDS區(qū)1 593 bp、3′側(cè)翼區(qū)26 bp)。并構(gòu)建了多個(gè)不同長度的5′缺失啟動子雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體,同時(shí)轉(zhuǎn)染A375和293T細(xì)胞,通過雙熒光素酶檢測體系檢測這3個(gè)基因啟動子活性,確定各基因啟動子的功能序列位置,并對該位置的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分別進(jìn)行定點(diǎn)突變,探究轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用。結(jié)果表明:1.CBD103基因缺失片段1 656 bp(-1 604/+51)區(qū)域的活性值最高,該區(qū)域的3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)Sp1(-1 552/-1 564)、Sp1(-1 439/-1 454)和Sp1(-329/-339)突變后,與野生型相比啟動子活性明顯下降。表明這3個(gè)位點(diǎn)為CBD103基因轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控區(qū)域。2.MITF-M基因缺失片段524 bp(-510/+13)區(qū)域的活性值最高,-222/-510區(qū)域?yàn)镸ITF-M基因的核心啟動子區(qū)域,該區(qū)域的3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)CREB(-312/-319)、Sp1(-295/-307)和Sp1(-249/-262)突變后,與野生型相比啟動子活性顯著上升。推測:(1)這3個(gè)位點(diǎn)為MITF-M基因的負(fù)調(diào)控區(qū)域;(2)這3個(gè)位點(diǎn)為MITF-M基因的正調(diào)控區(qū)域,但由于該位點(diǎn)發(fā)生DNA甲基化修飾,阻礙CREB和Sp1與其結(jié)合,抑制轉(zhuǎn)錄激活MITF-M基因啟動子的活性。3.TYR基因缺失片段2 066 bp(-2 033/+32)區(qū)域的活性值最高,該區(qū)域的3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)Sp1(-1 775/-1 785)、NF-1(-199/-208)和Sp1(-119/-129)突變后,與野生型相比啟動子活性顯著下降。表明這3個(gè)位點(diǎn)為TYR基因轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控區(qū)域。本研究最終確定北極狐CBD103、MITF-M和TYR基因啟動子區(qū)域及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用。
【圖文】：

極狐 DNA 樣品究所用北極狐皮膚組織樣品由河北省秦皇島市昌黎縣金島株究所用菌株大腸桿菌 DH5α 購自寶生物工程（大連）有限公司粒（載體）D 18-T Vector（Simple）載體購自寶生物工程（大連）有限公司載體（pGL3-Basic）、海腎熒光素酶載體（pRL-TK）和陽性-Control）均為北京原平皓生物技術(shù)有限公司贈送。 18-T Vector（Simple）：載體全長 2 692 bp。pMD 18-T VectorCR 產(chǎn)物 (TACloning) 的專用載體，（見圖 2-1）。

蟲熒光素酶載體（pGL3-Basic）：序列全長 4 818 bp，含）、多克隆位點(diǎn)和 SV40 poly A 信號等，但不存在真核啟通過在 Luc 基因上游插入目的片段表達(dá)熒光素酶活性，（
【學(xué)位授予單位】：河北科技師范學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q953

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2663411