【摘要】：泛素蛋白酶體途徑與配子體自交不親和密切相關(guān),其通過降解一些特異蛋白參與很多顯花植物的自交不親和過程,而泛素結(jié)合酶UBE2在泛素蛋白酶體途徑中起著重要的作用。課題組前期從香水檸檬自交不親和花的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到兩個泛素結(jié)合酶家族UBE2A和UBE2I同源基因片段,為了弄清該基因的特性以及與檸檬自交不親和的關(guān)系,開展了本研究。本研究以香水檸檬(自交不親和)和白花檸檬(自交親和)為試材,根據(jù)從檸檬花轉(zhuǎn)錄組得到的UBE2A和UBE2I同源基因片段,采用同源克隆的方法獲得了香水檸檬和白花檸檬2個品種的UBE2A和UBE2I同源基因的ORF和DNA全長,對其序列進行生物信息學分析,對其在兩個檸檬不同組織器官以及自花授粉與雜交授粉后不同時間段的表達模式進行分析,并對這兩個基因進行了亞細胞定位研究。其主要結(jié)果如下:1.通過測序和序列分析發(fā)現(xiàn),香水檸檬UBE2A同源基因的ORF全長是564 bp,DNA全長為1691 bp;白花檸檬UBE2A同源基因的ORF全長為315bp,較香水檸檬短249 bp,DNA全長為887 bp,較香水檸檬短804 bp。香水檸檬和白花檸檬的泛素連接酶UBE2I同源基因的ORF長度均為483bp,兩個品種ORF全長僅有一個堿基的差異;其同源基因的DNA序列均為2267 bp。2.利用生物學在線網(wǎng)站及軟件對UBE2A和UBE2I同源基因進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn),香水檸檬UBE2A同源基因共含有7個外顯子,其長度分別為:44 bp,81 bp,115 bp,52 bp,129 bp,105 bp,38 bp。6 個內(nèi)含子,其長度分別為:166 bp,145 bp,261 bp,366 bp,182 bp,7 bp。香水檸檬UBE2A同源基因的ORF全長為564 bp,編碼187個氨基酸,由20種氨基酸組成,其中含量最多的三種氨基酸分別是:Ser21(21,11.2%)、Asp18(18,9.6%)和 Glu16(16,8.6%);其理論分子量為 21200.77784 Da,等電點為4.29。香水檸檬UBE2A泛素連接酶蛋白的三級結(jié)構(gòu)有6個α螺旋,4個β折疊,10個無規(guī)卷曲。泛素化位點預測結(jié)果顯示香水檸檬UBE2A氨基酸序列的第149位氨基酸存在較高泛素化的可能性(score 0.85),第14(score 0.72)和148位(score 0.79)氨基酸存在中等的被泛素化的可能性,第133位(score 0.66)氨基酸存在較低的被泛素化的可能性。整條肽鏈呈現(xiàn)親水性,不含信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。在白花檸檬中,UBE2A同源基因含有4個外顯子,長度分別為:44bp,81 bp,115 bp,75bp,3個內(nèi)含子,長度分別為:166bp,145bp,261bp。在香水檸檬DNA的第四個段內(nèi)含子中的第885-887位堿基為TGA,是白花檸檬UBE2A的終止密碼子。白花檸檬UBE2A同源基因的ORF全長為315 bp,編碼104個氨基酸,由20種氨基酸組成,含量最多的五種氨基酸分別是:Ser(11,10.6%),Ile(9,8.7%),Val(8,8.7%),Lys(8,8.7%),Pro(8,8.7%)。白花檸檬UBE2A泛素連接酶蛋白的三級結(jié)構(gòu)有3個α螺旋,6個β折疊,7個無規(guī)卷曲。理論分子量為11845.73124Da,等電點為5.13。整條肽鏈呈現(xiàn)疏水性,不含信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。泛素化位點預測結(jié)果顯示白花檸檬UBE2A同源基因氨基酸序列中不存在泛素化的可能性。檸檬UBE2A同源基因蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域均為:UBCc superfamily。香水檸檬和白花檸檬UBE2I同源基因中均含有5段個內(nèi)含子,長度分別為70bp、81bp、157bp、112bp、63bp。4 個外顯子,長度分別為 77bp、1145bp、110bp、452bp。在第2、4個內(nèi)含子序列中存在兩個TATA盒樣結(jié)構(gòu)(TATAA)框的結(jié)構(gòu),也許這種序列與內(nèi)含子的功能密切相關(guān)。香水檸檬和白花檸檬UBE2I同源基因的ORF全長均為483bp,共編碼160個氨基酸,氨基酸組成及含量無差異。均由20種氨基酸組成,其中含量最高的三種氨基酸分別是Pro(16,10%),Gly(14,8.75%),Leu(13,8.125%)。其理論分子量為17981.47444Da,等電點為7.64。檸檬UBE2I同源基因蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域為:UBCcsuperfamily。檸檬UBE2I泛素連接酶蛋白的三級結(jié)構(gòu)有4個α螺旋,7個β折疊,10個無規(guī)卷曲。泛素化位點預測結(jié)果顯示檸檬UBE2I氨基酸序列的第28位氨基酸(Score為0.70)存在中等被泛素化的可能性,第111位(Score為0.64)氨基酸存在較低的被泛素化的可能性。SUMO修飾位點預測顯示UBE2I的第28和54位氨基酸存在SUMO化修飾的可能性。整條肽鏈呈現(xiàn)親水性,不含信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。3.利用SYBR實時熒光定量PCR對香水檸檬UBE2A、UBE2I基因在不同組織和香水檸檬自交、雜交授粉后不同時間段的表達情況進行分析。結(jié)果顯示,UBE2A和UBE2I同源基因在香水檸檬受試的11個組織中均表達,不同組織中的表達情況存在差異。其中UBE2A在花柱和花粉中有較高的表達量,在花柱中表達量最高,在莖、花托、子房中的表達量相對較低。UBE21在花粉、花絲的表達量較高,在花粉中表達量最高,在花托和老莖中的表達量相對較低。UBE2A在香水檸檬自交和雜交后不同時間段柱頭中的表達分析顯示,在自交授粉0-10h后,表達量略有上升,10h的表達量約為雜交授粉的2.5倍。在自交授粉10-15 h表達量出現(xiàn)下降,在自交授粉后15 h表達量下降至0 h的表達量水平,與雜交時表達量差不多;在自交授粉15h-1d表達量略有上升;在自交授粉后1-2d表達量顯著上升,2d的達到最大值,約為雜交后的25倍。UBE2E在柱頭中的表達分析顯示在自交授粉0 h-10 h后,表達量略有上升,10 h的表達量約為雜交授粉的4.5倍;在自交授粉10-20h表達量出現(xiàn)下降,在自交授粉后20h表達量下降至Oh的表達量水平,約為雜交時表達量的3倍;在自交授粉1d后表達量持續(xù)上升,在自交授粉4d時,表達量約為雜交后的5.5倍。綜上,結(jié)果顯示UBE2A和UBE21同源基因可能參與香水檸檬自交不親和而反應(yīng)。4.將構(gòu)建的瞬時表達載體P1300-GFP-UBE2A和P10300-GFP-UBE2I轉(zhuǎn)化到本氏煙草葉片中進行瞬時表達,共培養(yǎng)1-2d后,通過多光子激光共聚焦顯微鏡,借助綠色熒光蛋白GFP的熒光信號確定目標蛋白在細胞內(nèi)的分布。結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)P1300-GFP-UBE2A的煙草葉片細胞中,綠色熒光蛋白主要分布在細胞核中。在轉(zhuǎn)P1300-GFP-UBE2I的煙草葉片細胞中,綠色熒光蛋白主要分布于細胞膜中。5.構(gòu)建酵母重組質(zhì)粒 pGADT7-UBE2A,pGADT7-UBE2I 和 pGBKT7-F-box,并對pGBKT7-F-box進行了自激活和毒性檢測。證明了重組表達載體pGBKT7-F-box無自激活性和毒性。
【圖文】：

圖１－１本實驗技術(shù)路線圖逡逑Ｆｉｇ．１－１邋Ｔｈｅ邋ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ邋ｒｏａｄｍａｐ邋ｏｆ邋ｔｈｉｓ邋ｓｔｕｄｙ逡逑

Ｆｉｇ．２－１邋Ｔｈｅ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ａｔｌａｓ邋ｏｆ邋ｐｌ３００－ＧＦＰ逡逑２．１．３酶及生化試劑逡逑由大連ＴａＫａＲａ公司購買ＤＮＡＭａｋｅｒ、Ｍ－ＭＬＶ逆轉(zhuǎn)錄酶、ｐＭＤ１８－Ｔ載體、實時逡逑熒光定量試劑盒ＳＹＢＲ邋Ｐｒｅｍｉｘ邋Ｄｉｍｅｒ邋Ｅｒａｓｅｒ、ＤＮＡ小量純化試劑盒（ＭｉｎｉＢＥＳＴ邋Ｐｌａｓｍｉｄ逡逑Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋Ｋｉｔ邋Ｖｅｒ．４．０）、ＤＮＡ邋片段純化試劑盒（ＭｉｎｉＢＥＳＴＤＮＡ邋Ｆｒａｇｍｅｎｔ邋Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ逡逑Ｋｉｔ邋Ｖｅｒ．４．０）、酵母雙雜交系統(tǒng)（Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ邋Ｇｏｌｄ邋Ｙｅａｓｔ邋Ｔｗｏ－Ｈｙｂｒｉｄ邋Ｓｙｓｔｅｍ）等相關(guān)實逡逑驗耗材；由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司購買Ｂｉｏｓｐｉｎ膠回收試劑盒、瓊脂糖、逡逑ｄＮＴＰ、ＭｇＣ１２、ＫＯＨ、ＨＣ１、乙醇、ＭＥＳ、乙酰丁香酮、ＤＭＳＯ、氨芐青霉素、卡那霉逡逑素、利福平、有機溶劑過濾膜、ｌｍＬ注射器及引物合成、測序等業(yè)務(wù)；由衡陽原野實逡逑業(yè)有限公司購買醫(yī)用酒精消毒液；由北京天根生化科技有限公司購買ＴＩＡＮＧＥＮ多糖多逡逑酷植物總ＲＮＡ提取試劑盒（ＲＮＡｐｅｒｐ邋Ｐｕｒｅ邋Ｐｌａｎｔ邋Ｋｉｔ）等藥品；由Ｔｈｅｒｍｏ公司購買Ｄｒｅａｍ逡逑
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S666.5

【參考文獻】

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本文編號：2662444