【摘要】：全雌系在黃瓜育種中應(yīng)用,不僅可以增產(chǎn),還可以免去雜交制種過程中對親本去雄的步驟,省時省力。目前主要通過雜交的方式導(dǎo)入全雌基因,不僅育種周期長,費時費力,而且還容易產(chǎn)生連鎖累贅引入不良基因,增加育種風(fēng)險。利用CRISPR/Cas9定點基因編輯技術(shù)創(chuàng)制全雌系可以避免上述缺點。然而葫蘆科轉(zhuǎn)基因一直是世界范圍內(nèi)的研究難題,遺傳轉(zhuǎn)化體系地缺乏極大地滯后了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在葫蘆科植物中的應(yīng)用。本研究利用原位雜交檢測了黃瓜子葉多芽發(fā)生再生體系中再生基因CsSTM的表達(dá),結(jié)合切片分析我們發(fā)現(xiàn)再生芽起源于子葉U 口附近的上表皮細(xì)胞,并且再生位點在U 口的深處。利用35S:GFP作為報告基因監(jiān)測侵染過程,我們發(fā)現(xiàn)在侵染時施加真空負(fù)壓可以加強農(nóng)桿菌的侵染使之達(dá)到U 口深處,而采用普通浸泡的方法則只能侵染U 口的表層細(xì)胞。我們于是通過真空負(fù)壓法加強侵染并最終成功獲得了再生熒光芽。另外,在培養(yǎng)基中添加CO的供體Hemin,可以促進生根并降低轉(zhuǎn)基因苗的死亡率。通過同樣的策略,我們也成功獲得了甜瓜轉(zhuǎn)基因植株。進一步通過選用黃瓜內(nèi)源的CsU6啟動子和插入GFP獨立表達(dá)框,我們也對CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)進行了優(yōu)化。我們針對黃瓜三個基因的CsVFFB1,CsMLO8和CsGAD1進行基因編輯,數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明遺傳轉(zhuǎn)化的效率接近1 ‰;TO植株基因編輯效率為100%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于之前報道的20%。甜瓜中的控制全雌基因性狀的基因為CmWIP1,其編碼一個控制性別發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子。黃瓜中其同源基因CsWIP1功能未見報道。我們通過基因編輯敲除CsWIP1,并利用熒光輔助篩選在轉(zhuǎn)基因后代中獲得了 transgene-free的純合突變體Cswip1。Cswip1突變導(dǎo)致雌雄同株轉(zhuǎn)變?yōu)槿浦?雌花率提高了 7倍。Cswip1雌花的果實與野生型并無明顯差異,在黃瓜育種上有巨大的潛在應(yīng)用價值。本研究建立了一套簡單高效的黃瓜和甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系。通過優(yōu)化CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)提高了黃瓜中基因編輯的效率,并最終通過基因編輯CsWIP1創(chuàng)制了黃瓜全雌系種質(zhì)材料。
【圖文】：

我們選用經(jīng)典的以子葉為外植體誘導(dǎo)多芽發(fā)生的再生體系進行遺傳轉(zhuǎn)化實逡逑驗（Ｇａｌ－Ｏｎ邋ｅｔａｌ．，２００５），并采用傳統(tǒng)浸泡侵染的方法進行農(nóng)桿菌侵染。取剛萌發(fā)逡逑的種子，按如圖３．１邋Ａ所示準(zhǔn)備外植體，將外植體浸泡在農(nóng)桿菌懸浮液中１０邋ｍｉｎ逡逑１９逡逑

完成侵染（圖３．１邋Ｂ）。共培養(yǎng)三天后，在熒光體式顯微鏡下觀察到外植體Ｕ邋口處逡逑有少量熒光（圖３．１邋Ｃ），表明農(nóng)桿菌的侵染強度較弱。清洗掉農(nóng)桿菌后，將外植逡逑體轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上再生。三周后，發(fā)現(xiàn)大部分外植體均可再生形成芽（圖３．１逡逑Ｄ），表明該再生體系再生效率較高。然后在熒光顯微鏡下觀察時，，卻發(fā)現(xiàn)所得再逡逑生芽全部都為ＧＦＰ陰性。部分外植體產(chǎn)生ＧＦＰ陽性愈傷（圖３．１邋Ｅ和Ｆ），但分逡逑離這些愈傷繼續(xù)培養(yǎng)無法獲得再生植株。采用該方法經(jīng)大量實驗均未獲得ＧＦＰ逡逑陽性轉(zhuǎn)基因植株。逡逑３．１．２再生位點在Ｕ邋口深處逡逑通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株的過程可以分為侵染和再生兩個過程，首先逡逑農(nóng)桿菌侵染外植體的部分細(xì)胞，然后被侵染的細(xì)胞經(jīng)過分裂和分化再生為植株。逡逑在上述實驗中，ＧＦＰ活體監(jiān)測的結(jié)果顯示一定比例的外植體包含ＧＦＰ熒光愈傷，逡逑表明農(nóng)桿菌可以完成對外植體的侵染過程。子葉外植體經(jīng)三周的再生過程產(chǎn)生了逡逑大量再生芽
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士后
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S642.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 申順先;李學(xué)慧;路紅衛(wèi);姚麗娟;;3對基因連鎖關(guān)系判定與運算的簡明方法[J];生物學(xué)雜志;2015年06期

2 飛(馬單)健一;童堯明;;砧木在日本茄果類蔬菜栽培中的應(yīng)用[J];上海蔬菜;1988年04期

3 張菁;;按基因連鎖互遺傳規(guī)律,F_1自交的結(jié)果如何?[J];生物學(xué)教學(xué);1986年01期

4 彭建鐵;黃曉文;;產(chǎn)后抑郁與5-羥色胺轉(zhuǎn)運體基因連鎖多態(tài)區(qū)多態(tài)性及社會環(huán)境因素相關(guān)性分析[J];中國婦產(chǎn)科臨床雜志;2015年06期

5 許莉萍,陳如凱;與甘蔗抗黑穗病基因連鎖的RAPD標(biāo)記篩選(英文)[J];應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報;2004年03期

6 陳青,張銀東;與辣椒抗蚜性基因連鎖的RAPD標(biāo)記[J];園藝學(xué)報;2003年06期

7 王斌,伏建民,邱芳,謝緯武,王京兆,金德敏,李敬玲,楊蜀嵐,楊仁崔;TGMS水稻BAC庫的構(gòu)建及與TGMS基因連鎖的BAC克隆的篩選[J];遺傳;1998年S1期

8 吳寶山;王君;;巧用“整體代換法”解決基因連鎖的遺傳問題[J];中學(xué)生物教學(xué);2013年07期

9 張海霞;張海英;于廣建;張峰;毛愛軍;王永健;許勇;;與黃瓜抗枯萎病基因連鎖的RAPD標(biāo)記[J];華北農(nóng)學(xué)報;2006年02期

10 李雅妹,孫曉勉,何文,岳靜;兒童孤獨癥與5-羥色胺轉(zhuǎn)運體基因連鎖多態(tài)性區(qū)域的關(guān)聯(lián)性研究[J];臨床精神醫(yī)學(xué)雜志;2005年05期

相關(guān)會議論文 前8條

1 王瑞;黃河勛;林毓娥;梁肇均;陳清華;;與南瓜短蔓基因連鎖的分子標(biāo)記[A];中國園藝學(xué)會2011年學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2011年

2 許勇;張海英;康國斌;范敏;王永健;陳杭;;西瓜抗枯萎病基因連鎖的分子標(biāo)記的研究[A];中國園藝學(xué)會成立70周年紀(jì)念優(yōu)秀論文選編[C];1999年

3 張桂華;韓毅科;孫小紅;李淑菊;魏愛民;杜勝利;;與黃瓜抗黑星病基因連鎖的分子標(biāo)記研究[A];紀(jì)念天津科潤黃瓜研究所建所二十五周年論文摘要集（2001—2010）[C];2010年

4 王惠哲;李淑菊;劉秀峰;李平;霍振榮;管煒;;與黃瓜抗炭疽病相關(guān)基因連鎖的AFLP標(biāo)記的篩選[A];紀(jì)念天津科潤黃瓜研究所建所二十五周年論文摘要集（2001—2010）[C];2010年

5 王永博;劉毅;王亞茹;李曉;李勇;韓彥肖;王迎濤;;與梨抗黑星病基因連鎖的分子標(biāo)記研究[A];中國園藝學(xué)會2014年學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2014年

6 趙小明;劉朝良;魏國清;朱保建;;家蠶散卵Ng基因的SSR定位[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會2010年學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2010年

7 婁平;王曉武;楊寶軍;張延國;方智遠(yuǎn);;甘藍(lán)顯性核不育基因連鎖標(biāo)記及分子標(biāo)記輔助選擇高通量AFLP體系的建立[A];蔬菜分子育種研討會論文集[C];2004年

8 張桂華;杜勝利;王鳴;馬德華;;與黃瓜抗白粉病相關(guān)基因連鎖的AFLP標(biāo)記的獲得[A];紀(jì)念天津科潤黃瓜研究所建所二十五周年論文摘要集（2001—2010）[C];2010年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 楊麗;建立黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯技術(shù)體系以創(chuàng)制黃瓜全雌系種質(zhì)材料[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

2 楊紅文;豬Klf4、Klf5、Klf7和Egr2基因的克隆及分子特性研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

3 胡秉芬;春小麥抗麥長管蚜基因的定位[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前5條

1 張海霞;黃瓜抗枯萎病基因連鎖分子標(biāo)記的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

2 侯萬偉;楊樹速生性狀相關(guān)基因連鎖標(biāo)記的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2008年

3 王成;篩選與桃花粉育性基因連鎖的分子標(biāo)記及SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化[D];延邊大學(xué);2006年

4 曲薇;番茄部位雄性不育形態(tài)生理及Lst基因的精細(xì)定位[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

5 王春芳;水稻F_2代無性系群體重要數(shù)量性狀的QTL定位[D];揚州大學(xué);2002年

本文編號：2662216