發(fā)布時間：2020-05-13 16:21

【摘要】：全雌系在黃瓜育種中應用,不僅可以增產(chǎn),還可以免去雜交制種過程中對親本去雄的步驟,省時省力。目前主要通過雜交的方式導入全雌基因,不僅育種周期長,費時費力,而且還容易產(chǎn)生連鎖累贅引入不良基因,增加育種風險。利用CRISPR/Cas9定點基因編輯技術創(chuàng)制全雌系可以避免上述缺點。然而葫蘆科轉基因一直是世界范圍內(nèi)的研究難題,遺傳轉化體系地缺乏極大地滯后了CRISPR/Cas9基因編輯技術在葫蘆科植物中的應用。本研究利用原位雜交檢測了黃瓜子葉多芽發(fā)生再生體系中再生基因CsSTM的表達,結合切片分析我們發(fā)現(xiàn)再生芽起源于子葉U 口附近的上表皮細胞,并且再生位點在U 口的深處。利用35S:GFP作為報告基因監(jiān)測侵染過程,我們發(fā)現(xiàn)在侵染時施加真空負壓可以加強農(nóng)桿菌的侵染使之達到U 口深處,而采用普通浸泡的方法則只能侵染U 口的表層細胞。我們于是通過真空負壓法加強侵染并最終成功獲得了再生熒光芽。另外,在培養(yǎng)基中添加CO的供體Hemin,可以促進生根并降低轉基因苗的死亡率。通過同樣的策略,我們也成功獲得了甜瓜轉基因植株。進一步通過選用黃瓜內(nèi)源的CsU6啟動子和插入GFP獨立表達框,我們也對CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)進行了優(yōu)化。我們針對黃瓜三個基因的CsVFFB1,CsMLO8和CsGAD1進行基因編輯,數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明遺傳轉化的效率接近1 ‰;TO植株基因編輯效率為100%,遠遠高于之前報道的20%。甜瓜中的控制全雌基因性狀的基因為CmWIP1,其編碼一個控制性別發(fā)育的轉錄因子。黃瓜中其同源基因CsWIP1功能未見報道。我們通過基因編輯敲除CsWIP1,并利用熒光輔助篩選在轉基因后代中獲得了 transgene-free的純合突變體Cswip1。Cswip1突變導致雌雄同株轉變?yōu)槿浦?雌花率提高了 7倍。Cswip1雌花的果實與野生型并無明顯差異,在黃瓜育種上有巨大的潛在應用價值。本研究建立了一套簡單高效的黃瓜和甜瓜遺傳轉化體系。通過優(yōu)化CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)提高了黃瓜中基因編輯的效率,并最終通過基因編輯CsWIP1創(chuàng)制了黃瓜全雌系種質材料。
【圖文】：

我們選用經(jīng)典的以子葉為外植體誘導多芽發(fā)生的再生體系進行遺傳轉化實逡逑驗（Ｇａｌ－Ｏｎ邋ｅｔａｌ．，２００５），并采用傳統(tǒng)浸泡侵染的方法進行農(nóng)桿菌侵染。取剛萌發(fā)逡逑的種子，按如圖３．１邋Ａ所示準備外植體，將外植體浸泡在農(nóng)桿菌懸浮液中１０邋ｍｉｎ逡逑１９逡逑

完成侵染（圖３．１邋Ｂ）。共培養(yǎng)三天后，在熒光體式顯微鏡下觀察到外植體Ｕ邋口處逡逑有少量熒光（圖３．１邋Ｃ），表明農(nóng)桿菌的侵染強度較弱。清洗掉農(nóng)桿菌后，將外植逡逑體轉移到再生培養(yǎng)基上再生。三周后，發(fā)現(xiàn)大部分外植體均可再生形成芽（圖３．１逡逑Ｄ），表明該再生體系再生效率較高。然后在熒光顯微鏡下觀察時，，卻發(fā)現(xiàn)所得再逡逑生芽全部都為ＧＦＰ陰性。部分外植體產(chǎn)生ＧＦＰ陽性愈傷（圖３．１邋Ｅ和Ｆ），但分逡逑離這些愈傷繼續(xù)培養(yǎng)無法獲得再生植株。采用該方法經(jīng)大量實驗均未獲得ＧＦＰ逡逑陽性轉基因植株。逡逑３．１．２再生位點在Ｕ邋口深處逡逑通過遺傳轉化獲得轉基因植株的過程可以分為侵染和再生兩個過程，首先逡逑農(nóng)桿菌侵染外植體的部分細胞，然后被侵染的細胞經(jīng)過分裂和分化再生為植株。逡逑在上述實驗中，ＧＦＰ活體監(jiān)測的結果顯示一定比例的外植體包含ＧＦＰ熒光愈傷，逡逑表明農(nóng)桿菌可以完成對外植體的侵染過程。子葉外植體經(jīng)三周的再生過程產(chǎn)生了逡逑大量再生芽
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士后
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S642.2

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本文編號：2662216