【摘要】：白蠟蟲(chóng)(Ericerus pela Chavanness)是我國(guó)特有的一種資源昆蟲(chóng),由于它能分泌性質(zhì)優(yōu)異的蟲(chóng)白蠟,在中國(guó)已經(jīng)被人工養(yǎng)殖上千年,蟲(chóng)蠟主要用于蠟染、蠟燭、刻板模印、中藥等行業(yè)。蟲(chóng)白蠟是以高級(jí)飽和一元酸和高級(jí)飽和一元醇所構(gòu)成的酯類(lèi)為主要成分。酰基還原途徑是生物體內(nèi)蠟酯合成的主要途徑之一,即脂酰輔酶A(fatty acyl-CoA)在脂酰輔酶A還原酶(fatty acyl-CoAreductase,FAR)的作用下還原生成脂肪醇,脂肪醇和脂酰輔酶A在蠟酯合酶(wax synthase,WS)的作用下生成酯。前期研究表明白蠟蟲(chóng)fatty acyl-CoA reductase(EpFAR)基因是與泌蠟密切相關(guān)的基因之一,本研究主要采用分子生物學(xué)的相關(guān)技術(shù)方法,首先克隆獲得白蠟蟲(chóng)EpFAR基因,明確了白蠟蟲(chóng)EpFAR基因的序列特征,分析該基因在蟲(chóng)體內(nèi)各組織的轉(zhuǎn)錄水平和編碼蛋白的表達(dá)譜,進(jìn)一步在培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)EpFAR蛋白,通過(guò)檢測(cè)EpFAR酶的生物反應(yīng)產(chǎn)物明確基因EpFAR的功能。獲得的主要結(jié)果如下:1白蠟蟲(chóng)EpFAR序列特征與系統(tǒng)發(fā)育本文在課題組前期研究得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析基礎(chǔ)上,選擇其中的脂酰輔酶A還原酶基因序列片段,采用RACE擴(kuò)增技術(shù),克隆得到了EpFAR基因的3’端和5’端序列,經(jīng)DNAMAN軟件拼接后,上傳至NCBI在線比對(duì),與其他生物的脂肪酰輔酶A還原酶基因同源,證明所得的基因?yàn)榘紫炏x(chóng)的脂肪酰輔酶A還原酶基因,獲得了該基因全長(zhǎng)cDNA,命名為EpFAR。基因EpFAR開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1569 bp,共編碼522個(gè)氨基酸,分子量為60.3kDa,該基因具有典型的FAR基因的特征,屬于SDR superfamily成員,屬于NADB_Rossmann superfamily成員,FAR_C superfamily成員。在其氮端具有特異的FAR-N_SDR_e結(jié)構(gòu)域(22-353aa),NAD_binding_4結(jié)構(gòu)(26-297 aa),以及Extended SDRs所有的典型的輔因子結(jié)合基序TGXXGXXG(24-34aa),Classical SDRs所具有的活性位點(diǎn)基序YXXXK(216-220aa),在其碳端具有特異的FAR_C結(jié)構(gòu)域(387-477),Sterile結(jié)構(gòu)(388-479aa)。該基因所具有的保守結(jié)構(gòu)域表明該基因序列較為復(fù)雜,可能參與復(fù)雜的代謝途徑,發(fā)揮不同的分子功能。通過(guò)MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明,白蠟蟲(chóng)EpFAR與扶桑粉蚧Phenacoccus solenopsis的FAR聚為一枝,與豌豆長(zhǎng)管蚜Acyrthosiphon pisum FAR、果蠅Drosophila melanogaster WAT等脂酰輔酶A還原酶較近,這些基因多數(shù)參與蟲(chóng)體蠟質(zhì)物的合成,而與其他昆蟲(chóng)如玉米螟、巢蛾、蝶類(lèi)、斑螟、蟻類(lèi)、蜂類(lèi)以及哺乳類(lèi)的脂肪酰輔酶A還原酶距離較遠(yuǎn),這些基因或者與昆蟲(chóng)性信息素合成相關(guān),或者與醚酯等物質(zhì)的合成相關(guān)。這種關(guān)系體現(xiàn)了序列相似性與功能相似性一致的特點(diǎn)。2白蠟蟲(chóng)EpFAR多克隆抗體為了研究基因EpFAR的功能和表達(dá)特征,選擇EpFAR的一段特異性強(qiáng)的多肽序列作為抗原區(qū),合成制備抗原肽,并與載體蛋白匙孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián),多次免疫新西蘭大白兔,獲得高效價(jià)的抗血清。經(jīng)過(guò)抗血清的親和純化,成功制備了白蠟蟲(chóng)脂肪酰輔酶A還原酶多克隆抗體。所得抗體效價(jià)為5.12×10~5,具有較高的免疫原性和較高的純度,抗體的濃度達(dá)0.7 mg/ml,可以滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。3白蠟蟲(chóng)EpFAR基因轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達(dá)譜、亞細(xì)胞定位以實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)進(jìn)行的表達(dá)量測(cè)定結(jié)果顯示,在雄性白蠟蟲(chóng)二齡泌蠟高峰期,基因EpFAR的轉(zhuǎn)錄主要在白蠟蟲(chóng)的表皮組織中發(fā)生,而在脂肪體、馬氏管、消化道以及精巢中的mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)低,在消化道中的轉(zhuǎn)錄水平最低,表皮中的轉(zhuǎn)錄水平與其他組織中的轉(zhuǎn)錄水平差異顯著,提示EpFAR轉(zhuǎn)錄的發(fā)生可能與表皮中蠟腺的生理代謝相關(guān)。以免疫熒光技術(shù)測(cè)定EpFAR蛋白的表達(dá)譜,結(jié)果顯示,在雄性白蠟蟲(chóng)二齡泌蠟高峰期,EpFAR蛋白主要在白蠟蟲(chóng)表皮蠟腺和精巢中表達(dá),在其他組織部位檢測(cè)不到紅色熒光,提示該蛋白的表達(dá)可能與蠟腺和精巢的生理代謝相關(guān),或者受到特定基因的調(diào)控。利用在線分析工具PSORT和Euk-mPLoc 2.0分析EpFAR蛋白的亞細(xì)胞定位顯示,EpFAR蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。免疫熒光技術(shù)檢測(cè)EpFAR蛋白定位結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。4白蠟蟲(chóng)EpFAR在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)與功能為了在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)基因EpFAR,本研究選擇昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中pFastBac HT B作為表達(dá)載體,利用PCR技術(shù)將基因EpFAR的開(kāi)放閱讀框ORF序列與表達(dá)載體序列相聯(lián),酶切分析、測(cè)序分析表明成功獲得了重組表達(dá)載體pFastBac HT-FAR。以重組表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化該載體宿主菌獲得重組的桿粒,PCR鑒定表明所得桿粒包含目標(biāo)基因的ORF序列。以所得桿粒轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞,蛋白電泳和免疫熒光技術(shù)表明成功獲得了重組的桿狀病毒,基因EpFAR在昆蟲(chóng)細(xì)胞中成功表達(dá)。經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后的病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的大量表達(dá)。收獲昆蟲(chóng)細(xì)胞并提取蛋白用于酶活性與功能分析實(shí)驗(yàn)。GC-MS檢測(cè)結(jié)果表明,所表達(dá)的白蠟蟲(chóng)EpFAR在本實(shí)驗(yàn)條件下具有生物活性,能將特定的底物二十六酰輔酶A(26:0-CoA)還原生成相應(yīng)的脂肪醇26:0-OH。進(jìn)一步研究其反應(yīng)的條件表明,所表達(dá)的白蠟蟲(chóng)EpFAR需要NADPH作為酶反應(yīng)的輔因子,而NADH存在與否并不影響EpFAR的活性與功能;所得EpFAR酶液在25℃至40℃范圍內(nèi)均具有還原活性;與其他緩沖系統(tǒng)相比,當(dāng)pH值為6.4時(shí),在該反應(yīng)系統(tǒng)中酶的活性受到一定程度的抑制,GC-MS檢測(cè)未能識(shí)別到相應(yīng)于所添加底物的脂肪醇;在三種不同鏈長(zhǎng)的底物存在時(shí),與二十四酰輔酶A(24:0-CoA)和二十二酰輔酶A(22:0-CoA)相比,EpFAR酶優(yōu)先選擇26:0-CoA作為酶反應(yīng)的底物,生成26:0-OH�？梢�(jiàn),白蠟蟲(chóng)EpFAR具有脂肪酰輔酶A還原酶家族基因所具有的還原特性,并且具有生成醇的能力,該反應(yīng)與蠟酯合成途徑的�；�原途徑相一致,酰基輔酶A受�；o酶A還原酶催化,在輔因子NADPH作用下,形成主要醇,用于蠟酯生物合成。
【圖文】：

4圖1 植物表皮長(zhǎng)鏈�；o酶A的合成。FAS，脂肪酸合成酶復(fù)合體；β-酮酰�；d體蛋白合成酶；ACP，�；d體蛋白；FAT，脂肪酰酰基載體蛋白硫解酶；LACS，長(zhǎng)鏈�；o酶A合成酶。Figure 1 Biosynthesis process of long-chain acyl-CoA in plants cuticular layer. FAS, fatty acidsynthase complex；KAS, β-ketoacyl ACP synthase；ACP, acyl-carrier-protein；FAT, fatty acyl-ACP thioesterase；LACS, long-chain acyl-CoA synthase.在擬南芥等植物中，C16和C18脂肪酸碳鏈延長(zhǎng)受與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相聯(lián)的被稱(chēng)為脂肪酸延長(zhǎng)酶的多酶系統(tǒng)（fatty acyl-CoA elongase system）的催化，在質(zhì)體中飽和的十六碳或十八碳脂酰輔酶A延長(zhǎng)，產(chǎn)生20-34個(gè)碳原子的超長(zhǎng)鏈脂肪酸（very long chain fattyacids,VLCFAs）

[47]。植物體表皮蠟的代謝途徑主要存在四種情況（如圖2），�；o酶A前體在酰基輔圖2 生物表皮蠟酯代謝途徑（Kolattukudy, P.E., 1996；Samuels L, Kunst L, Jetter R,,2008）.①�；o酶A硫酯酶；②脂酰輔酶還原酶；③醛脫羰酶；④中鏈烷烴羥化酶；⑤蠟質(zhì)合成酶/甘油二酯�；D(zhuǎn)移酶Figure 2 Proposed biosynthesis pathway of cuticular wax in organisms（Refer to Kolattukudy,P.E., 1996；Samuels L, Kunst L, Jetter R ，2008）. ①Acyl-CoA thioesterase，ACOT；②Fattyacyl-CoA reductase，F(xiàn)AR；③Aldehyde decarbonylase；④mid-chain alkane hydroxylase，，MAH1；⑤Wax ester synthase/diacylglycerol acyltransferase
【學(xué)位授予單位】：南京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S899.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2662156