發(fā)布時(shí)間：2020-05-10 14:54

【摘要】：裂腹魚亞科魚類是青藏高原魚類區(qū)系中的主體成分之一,而花斑裸鯉是其中的一個(gè)代表物種,鑒于花斑裸鯉對(duì)高原淡水生態(tài)系統(tǒng)中的重要地位以及對(duì)高原環(huán)境極強(qiáng)的適應(yīng)性,本研究應(yīng)用Illumina HiSeqTM 2500技術(shù)對(duì)花斑裸鯉肝胰臟、肌肉、腦、腎和血液混合組織轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序、轉(zhuǎn)錄本組裝和基因功能注釋,通過常氧(DO=8.4±0.1 mg/L)和低氧脅迫(DO=3.0±0.1 mg/L)處理比較進(jìn)行低氧適應(yīng)相關(guān)基因差異表達(dá)及其通路富集分析,采用Real-time PCR檢測(cè)了花斑裸鯉重度低氧和中度低氧處理后差異基因在關(guān)鍵組織中的表達(dá)水平,目的在于探討花斑裸鯉低氧適應(yīng)的生物學(xué)過程和分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:(1)通過花斑裸鯉混合組織轉(zhuǎn)錄本組裝,共獲得551 430條轉(zhuǎn)錄本,轉(zhuǎn)錄本總長(zhǎng)達(dá)476 992 977 bp,其中有33 7481條unigene序列,大小為221 260 249 bp。序列組裝結(jié)果滿足后續(xù)分析的基本要求。(2)對(duì)unigenes進(jìn)行七大數(shù)據(jù)庫(kù)的基因功能注釋,發(fā)現(xiàn)注釋最多的是Nt數(shù)據(jù)庫(kù)(117 993,34.96%),其次是GO數(shù)據(jù)庫(kù)(50 492,14.96%),最少的的KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(20 660,6.12%)。Nr數(shù)據(jù)庫(kù)注釋表明,花斑裸鯉unigenes與斑馬魚的基因有62.1%相似性,此結(jié)果與兩者都是鯉科魚類是一致的。(3)花斑裸鯉組織差異表達(dá)基因分析結(jié)果表明,在低氧條件下肝胰臟、心臟、血液、腦和肌肉組織中分別有28、30、74、60和282個(gè)差異基因。差異基因GO富集發(fā)現(xiàn),在低氧條件花斑裸鯉只有3個(gè)組織富集到GO條目,其中在腦、肝胰臟組織中主要富集的基因與分子功能有關(guān),肌肉中富集到的與分子功能基因、細(xì)胞組分基因和生物學(xué)過程基因密切相關(guān)。(4)KEGG通路富集表明,血液中11差異基因富集到9個(gè)KEGG通路中;腦組織中5個(gè)差異基因富集到5個(gè)KEGG通路中;肌肉組織中75個(gè)差異基因富集到29個(gè)KEGG通路中;肝胰臟中13個(gè)差異基因富集到10個(gè)KEGG通路中。上述結(jié)果揭示,花斑裸鯉應(yīng)對(duì)低氧環(huán)境將加強(qiáng)糖酵解途徑功能和糖異生作用,增強(qiáng)HIF-1信號(hào)通路功能,強(qiáng)化抗氧化防御系統(tǒng),抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)及促進(jìn)受損細(xì)胞的凋亡,從而提高機(jī)體的低氧耐受和存活能力。(5)重度和中度低氧條件下,花斑裸鯉HIF-1aA/B和HIF-2αA/B在各組織中的表達(dá)模式不盡相同。研究結(jié)果表明HIF-1a和HIF-2α的表達(dá)水平隨低氧程度不同表現(xiàn)為明顯的組織特異性,從而提示花斑裸鯉可能存在兩種不同的機(jī)制分別來(lái)應(yīng)對(duì)中度低氧和重度低氧環(huán)境。(6)在重度低氧條件下,腦和肌肉組織中EPO mRNA表達(dá)顯著增加,而在中度低氧條件下,EPO mRNA表達(dá)在主要組織中趨于先增加后下降的趨勢(shì)。此結(jié)果表明,花斑裸鯉通過提高EPO的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)增強(qiáng)血液攜氧能力,加強(qiáng)了機(jī)體的低氧耐受性。同時(shí),通過EPO反饋機(jī)制使機(jī)體紅細(xì)胞保持在正常水平,進(jìn)而使機(jī)體在長(zhǎng)期低氧環(huán)境下生理功能保持正常。(7)在重度低氧條件下,花斑裸鯉通過增強(qiáng)VEGF mRNA的表達(dá)促進(jìn)血管新生和增加血管的通透性來(lái)適應(yīng)短時(shí)間的缺氧環(huán)境;通過VEGF mRNA系統(tǒng)的負(fù)反饋機(jī)制調(diào)控新血管形成適應(yīng)長(zhǎng)期低氧環(huán)境。
【圖文】：

S 條帶清晰可見，且濃度比值大約為 2:1，說(shuō)明提取的肝胰臟、腦、心臟、肌和血液組織總 RNA 的完整性良好，基本沒有降解；用分光光度計(jì)測(cè)得 A260280 為 1.8～2.2，表明提取到的 RNA 純度很高，能夠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2 花斑裸鯉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量評(píng)估通過Illumina HiSeq 2500 雙末端測(cè)序，30個(gè)獨(dú)立的測(cè)序庫(kù)產(chǎn)生了918 millionired-end reads。經(jīng)過濾去除接頭、不確定堿基和低質(zhì)量的 1754 million 序列后到高質(zhì)量測(cè)序序列（clean reads）219.12 G 進(jìn)行后續(xù)分析。每個(gè)樣本的高質(zhì)量序數(shù)范圍從 50.9 million（clean bases = 6.36 G）到 69.8 million（clean bases = 8.72），平均大小為 58.5 million。其中對(duì)照組中高質(zhì)量序列為 872.0 million（cleanses = 109.04 G），低氧組中高質(zhì)量序列為 881.7 million (clean bases = 110.08 G)表 2.2）。對(duì)花斑裸鯉常氧和低氧組的血液、腦、心、肌肉和肝胰臟混合轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行堿基分布和測(cè)序質(zhì)量分布檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) GC 含量均在 48%，Q30均在 91%圖 2.1），說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量較高。

海大學(xué)碩士學(xué)位論文 第 2 章 花斑裸鯉低氧脅迫轉(zhuǎn)錄組研究3000 202 1448 6230Total897850960871974340109.04 Total939835046881699956110.08注：BL 為血液；HT 為肝胰臟；B 為腦；H 為腎臟；M 為肌肉.3 混合轉(zhuǎn)錄本的組裝依據(jù)常氧組4種組織和血液RNA測(cè)序的Illumina reads數(shù)據(jù)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄本的步組裝，共獲得 551 430 條轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)錄本總長(zhǎng)達(dá) 476 992 977 bp，長(zhǎng)度范圍 201～34 873 bp，平均長(zhǎng)度為 865 bp（圖 2.2a）。在拼接結(jié)果序列中，共有 33481 條 unigene 序列，，大小為 221 260 249 bp，長(zhǎng)度范圍為 201～34 873 bp，平長(zhǎng)度 656 bp（圖 2.2b）。其中小于 300 bp 轉(zhuǎn)錄本（55 590）和 unigene（48 839）序列最多。隨長(zhǎng)度增加轉(zhuǎn)錄本與 unigene 數(shù)量差距也變大（圖 2.2）。
【學(xué)位授予單位】：青海大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2657473