【摘要】：二球懸鈴木(Platanus acerifolia Willd)是一種被人們廣泛栽培的行道樹種,它有很多優(yōu)點(diǎn),如栽培容易、生長迅速、樹形挺俊、冠大蔭濃、抗病蟲害等。但是,二球懸鈴木在每年春末夏初之時(shí),大量花粉隨風(fēng)飛灑,同時(shí)隔年的種球散開脫落,造成“飄粉飛毛”現(xiàn)象,嚴(yán)重影響人們的工作生活,很大程度上限制了推廣應(yīng)用。本研究通過分析懸鈴木AGAMOUS(AG)基因第二內(nèi)含子的表達(dá)特性,進(jìn)而驅(qū)動細(xì)胞毒素基因培育不育轉(zhuǎn)基因植株的策略,來解決懸鈴木花粉和種毛污染問題。我們先通過TAIL-PCR的方法分離得到二球懸鈴木AG基因第二內(nèi)含子,然后用內(nèi)含子驅(qū)動GUS基因和毒性基因構(gòu)建融合表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化煙草與擬南芥對內(nèi)含子的表達(dá)特性和功能進(jìn)行分析鑒定,主要研究成果如下:1.AG基因第二內(nèi)含子具有調(diào)控AG基因特異表達(dá)的特性,因此克隆了二球懸鈴木AG同源基因Plac AG基因4644bp第二內(nèi)含子的序列,命名為Plac AGI,利用生物信息學(xué)的方法對Plac AGI序列的調(diào)控元件做了初步的預(yù)測分析,分析結(jié)果證明Plac AGI包含了大量的組織特異調(diào)控元件。2.構(gòu)建了f Plac AGI::GUS,r Plac AGI::GUS,f Plac AGI-mi35S::GUS,r Plac AGImi35S::GUS融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化了煙草與擬南芥,通過對轉(zhuǎn)基因植株的組織進(jìn)行GUS染色檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)GUS表達(dá)基因的煙草和擬南芥的雌蕊和雄蕊中GUS特異表達(dá),在其它部位GUS基因未表達(dá)。這表明Plac AGI具有嚴(yán)格的組織特異性,能夠調(diào)控連接在其下游的基因在花的第三、四輪器官特異表達(dá)。3.構(gòu)建了不育植物表達(dá)載體fPlacAGI::Barnase-mi35S-Barstar,r Plac AGI::Barnase-mi35S-Barstar,f Plac AGImi35S::Barnase-mi35S-Barstar,r Plac AGImi35S::Barnase-mi35S-Barstar并轉(zhuǎn)化煙草,得到四種載體的轉(zhuǎn)基因陽性植株,通過對陽性植株的表型觀察與分析,結(jié)果表明,AG基因第二內(nèi)含子能夠特異的調(diào)控連接在其下游的Barnase基因特異的表達(dá)于轉(zhuǎn)基因煙草的雄蕊和心皮,導(dǎo)致這兩輪花器官消融。同時(shí),轉(zhuǎn)化煙草出現(xiàn)強(qiáng)表型和弱表型之分,強(qiáng)表型植株花的第二、三、四輪花器官均消融,花直接早落;弱表型植株僅第三、四輪花器官消亡。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)懸鈴木AG基因第二內(nèi)含子正向與反向插入載體對其功能的行使有影響,正向插入時(shí)轉(zhuǎn)基因煙草的表型更為明顯。還發(fā)現(xiàn)Plac AGI具有微弱的啟動子功能,在其下游沒有連接60bp35S核心啟動子片段的情況下也能特異的啟動緊連在其下游的表達(dá)基因特異表達(dá)。
【圖文】：

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士研究生學(xué)位論文各種研究與發(fā)現(xiàn)提出了四聚體模型（FQM）（Thei en 2001）。該模型認(rèn)為花的各個(gè)花器官的分化發(fā)育由 MIKC-type MADS-box 蛋白組成的四聚體來調(diào)控（Thei en2001，Yan et al 2016）�；� ABCDE 模型以及考慮到被子植物所獨(dú)有的心皮結(jié)構(gòu)加上所有種子植物（包括裸子植物）都存在的胚珠，一個(gè)更復(fù)雜的四聚體模型被提出（Thei en and Melzer 2006）（具體見圖 1）。這些四聚體被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄因子，通過與目標(biāo)基因的 DNA 結(jié)合，，它們可以激活或抑制以控制各自的花器官的發(fā)育（Thei en etal 2016）。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 屆碩士研究生學(xué)位論文表 8 菌落 PCR 反應(yīng)體系Table 8 Bacterial colony PCR reaction system in this study號 循環(huán)數(shù) 參 數(shù) 1 94℃， 3 min 35 94℃， 30s； 62℃， 30s；72℃， 2.5min 1 72℃， 10 min取陽性單菌落中的一個(gè)搖菌來提取質(zhì)粒，具體方法同上。將提取的質(zhì)粒用 Sl I 進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切體系同上，酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳來進(jìn)行檢測
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S687.1

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