發(fā)布時間：2020-05-09 19:24

【摘要】：結(jié)球甘藍(lán)(Brassica oleracea L.var.Capitata)屬十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種的一個變種,是典型的異花授粉植物,長期以來利用其花期自交不親和的特點(diǎn)進(jìn)行甘藍(lán)優(yōu)勢育種,但因自交不親和系的配制雜交率難以達(dá)到100%而存在假雜種問題,且繁殖依賴人工蕾期授粉,效率低,成本高。進(jìn)入本世紀(jì)以后,甘藍(lán)優(yōu)勢育種逐漸轉(zhuǎn)向雄性不育系的選育和利用。擴(kuò)大雄性不育源,創(chuàng)制雄性不育的突變體材料成為甘藍(lán)育種的重要內(nèi)容。模式植物擬南芥中基于AG(AGAMOUS)基因通路下的花粉發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)日臻清晰,MALE STERILITY1(MS1)是該網(wǎng)絡(luò)中的一個關(guān)鍵基因,其編碼PHD-finger結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子,在擬南芥、油菜、水稻、大麥中被發(fā)現(xiàn)參與雄性不育調(diào)控。茉莉酸合成代謝除參與自身防御系統(tǒng)外,在花藥的開裂方面起著重要的作用。目前,甘藍(lán)基于雄性不育途徑的優(yōu)勢育種主要利用來自蘿卜的ogura-CMS細(xì)胞質(zhì)雄性不育,存在不育源單一的問題,為擴(kuò)大甘藍(lán)雄性不育資源,同時解決其自交不親和影響繁殖的問題,本文應(yīng)用RNA干擾技術(shù)和CRISPR/Cas9技術(shù)對BoMS1基因、BoAOS基因和自交不親和的關(guān)鍵基因BoSRK基因協(xié)同調(diào)控及編輯突變,創(chuàng)制甘藍(lán)與保持系雜交親和的雄性不育材料。本研究獲得的結(jié)果如下:1.構(gòu)建針對擬南芥突變體ms1ms1的功能回復(fù)載體pCA13BarPMS1MS1和用于轉(zhuǎn)化甘藍(lán)的BoMS1基因的RNAi干擾載體pCA13BarPMS1iMS1。通過花序侵染法獲得擬南芥T1代植株,經(jīng)500ppm的PPT篩選后獲得12株轉(zhuǎn)基因擬南芥。經(jīng)過基因型鑒定,得到3株基因型背景為ms1/ms1的pCA13BarPMS1MS1轉(zhuǎn)基因擬南芥,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在開花以后花粉正常,其余表型也與基因型為MS1/ms1的擬南芥無差異。與對照ms1ms1不育株相比,角果正常伸長并膨大。pCA13BarPMSiMS1表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入甘藍(lán)中,獲得轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)7株,其中1株為完全不育,表現(xiàn)為花柱突出,花絲短縮,花藥肥大而無花粉,其余表型與可育株一致。其他植株盡管有花粉,經(jīng)0.5%的TTC染色后顯示活力存在不同程度的降低。上述結(jié)果證明甘藍(lán)BoMS1基因卷入甘藍(lán)育性的調(diào)控。2.構(gòu)建BoMS1基因和BoSRK基因RNAi雙干擾載體pCA13BariMS1/iSRK、BoMS1基因和BoSRK基因雙敲除的載體pCas-tBoMS1-ABCD/tBoSRK-ABCD轉(zhuǎn)化甘藍(lán)自交不親和系“F416”(SRK3單倍型)。獲得pCA13BariMS1/iSRK轉(zhuǎn)基因植株21株,除1株外,其他植株開花后花藥干癟,無花粉,其他表型與野生型無差異。1株轉(zhuǎn)基因植株有花粉但花粉發(fā)白,經(jīng)0.5%的TTC染色后發(fā)現(xiàn)多數(shù)花粉粒無活力。獲得pCas-tBoMS1-ABCD/tBoSRK-ABCD轉(zhuǎn)基因植株18株,其中有6個單株發(fā)生了雙基因敲除,針對BoMS1基因的突變頻率為33.33%,BoSRK基因的突變頻率達(dá)到72.22%,雙突變的頻率為33.33%。雙敲除的轉(zhuǎn)基因植株除1株死亡外,其余5株轉(zhuǎn)基因植株正常開花。早期低溫(20℃)下,花藥在花瓣開放前就停止生長,花藥敗育,無花粉;后期溫度回升到25℃后,有4株花藥發(fā)育正常,花粉出現(xiàn)程度不同活性下降,但1株仍表現(xiàn)花藥徹底敗育,無花粉產(chǎn)生。通過花粉原位萌發(fā)的熒光顯微觀察檢測pCA13BariMS1/iSRK和pCas-tBoMS1-ABCD/tBoSRK-ABCD轉(zhuǎn)基因植株(花期和蕾期與野生型雜交)的自交親和性,結(jié)果顯示蕾期雜交的花粉管萌發(fā)情況與野生型蕾期自交無異,而花期雜交的花粉管萌發(fā)明顯優(yōu)于野生型花期自交。結(jié)果表明同時進(jìn)行BoMS1基因和BoSRK基因調(diào)控能夠產(chǎn)生雄性不育且與保持系雜交親和的甘藍(lán)材料。3.構(gòu)建BoAOS基因和BoSRK基因RNAi載體pCA13BariAOS/iSRK和BoAOS基因及BoSRK基因雙敲除載體pCas-BoAOS-AB/tBoSRK-ABCD轉(zhuǎn)化甘藍(lán)下胚軸。獲得9株pCA13BariAOS/iSRK轉(zhuǎn)基因植株,為確定針對BoAOS基因的干擾效果,對2株轉(zhuǎn)基因植株接種軟腐病前后的BoAOS基因和BoOPR3基因進(jìn)行RT-PCR分析,結(jié)果顯示:野生型植株的BoAOS基因和BoOPR3基因的表達(dá)在接種后有所上升,但轉(zhuǎn)基因植株在接種后兩個基因的表達(dá)量不升反降,證明對BoAOS基因的干擾有效。但開花后植株花藥發(fā)育正常,花粉有活力,部分植株花粉活力有所下降,與野生型植株花期雜交親和性提高。獲得pCas-BoAOS-AB/tBoSRK-ABCD轉(zhuǎn)基因植株50株,其中7株發(fā)生雙基因敲除。針對BoAOS基因的突變頻率為14.00%,BoSRK基因的突變頻率為86.00%,雙突變的頻率為14.00%。7株雙敲除的轉(zhuǎn)基因植株中1株因病而亡,其余6株正常開花。開花早期,花粉散粉異常,對其花粉活力鑒定顯示花粉活力低于野生型;后期花粉的散開正常,但單株之間的花粉活力仍然存在差異。通過花粉原位萌發(fā)熒光顯微觀察檢測pCas-BoAOS-AB/tBoSRK-ABCD轉(zhuǎn)基因植株(花期和蕾期與野生型雜交)的自交親和性,結(jié)果顯示花期雜交的花粉管萌發(fā)明顯強(qiáng)于野生型植株的花期自交。
【圖文】：

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文粉可以繁殖保持系和雄性不育系。2002 年，Perez-Prat 等（Perez-Prat & van LookerenCampagne，2002）提出了一套基于核基因控制雄性不育完全保持的設(shè)想。該設(shè)想的核心是將相應(yīng)的育性恢復(fù)基因（針對顯性不育/隱性不育）、花粉致死基因和育性標(biāo)記基因緊密連鎖并導(dǎo)入對應(yīng)的純合核不育系中，建立相應(yīng)的保持系，實現(xiàn)核不育系的 100%保持�；谶@些設(shè)想，杜邦先鋒公司設(shè)計了玉米種子生產(chǎn)技術(shù)，

第 1 章 文獻(xiàn)綜述只適用于保持系栽培，而保持系的栽培只需小面不需要轉(zhuǎn)基因監(jiān)督。目前該技術(shù)已成功地實現(xiàn)了ang et al.，2016）中保持系和不育系的簡便繁殖，隱性不育系的保持，主要是因為在甘藍(lán)中控制隱的隱性不育系還未建立。關(guān)基因研究器官建成的 ABCE 模型，BCE 類基因共同決定雄發(fā)育由 ABC 三組同源異形基因控制（Coen et alAPETALA1（AP1）和APETALA2（AP2），B組基因包LATA（P1），，C 組基因包括 AGAMOUS（AG）和
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S635

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2656619