【摘要】：小麥(Triticum aestivum L.)是主要的糧食作物。分蘗是包括小麥在內(nèi)的單子葉禾本科植物最重要的農(nóng)藝性狀之一,直接影響小麥結(jié)實進而影響單產(chǎn),因此小麥的分蘗研究具有重要的發(fā)育生物學(xué)意義。水稻(Oryza sativa L.)的MOC1基因是控制其分蘗的發(fā)生及分蘗芽生長的關(guān)鍵基因。本課題組前期已分離了TaMOC1基因,并對其表達模式及功能進行了初步探究。基因表達的調(diào)控包括轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控和翻譯后蛋白水平的調(diào)控等,但轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是最重要的,而啟動子的調(diào)控作用在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是最重要的。因此,啟動子的序列、結(jié)構(gòu)及其功能元件的研究對于了解基因表達調(diào)控原理非常重要。在本課題的研究中,我們克隆了TaMOC1的啟動子序列并對它的序列結(jié)構(gòu)及作用元件進行初步分析。同時,為了深入探究TaMOC1的功能,我們利用CRISPR/Cas的方法構(gòu)建TaMOC1定點突變的表達載體,以小麥幼胚為材料,進行小麥遺傳轉(zhuǎn)化實驗。具體研究結(jié)果如下:(1)半定量實驗的分析結(jié)果顯示TaMOC1-7A、TaMOC1-7B、TaMOC1-7D在根、莖尖、葉和小穗中均有表達,其中在莖尖中TaMOC1-7B表達量較高。(2)TaMOC1-7A、TaMOC1-7B、TaMOC1-7D的啟動子序列順式作用元件的分析結(jié)果顯示它們啟動子中含有多種調(diào)控元件。分蘗受多種因素影響。因此我們推測:TaMOC1啟動子可能通過多種激素誘導(dǎo)調(diào)控TaMOC1表達,并與逆境脅迫信號途徑有關(guān),并且TaMOC1啟動子可能通過與分生組織表達有關(guān)的順式調(diào)控元件參與TaMOC1調(diào)控小麥分蘗。(3)P_(TaMOC1-7D)::GUS、P_(TaMOC1-7D)P1::GUS、P_(TaMOC1-7D)P2::GUS擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化實驗的結(jié)果表明CAT-box調(diào)控元件決定了TaMOC1的表達部位,對于TaMOC1啟動子的活性有重要意義。(4)我們得到了5株pBUE411-TaMOC1-Cas9 T0代轉(zhuǎn)基因植株,植株育性較差。同時,我們已獲得部分T1代轉(zhuǎn)基因植株測序結(jié)果,測序結(jié)果表明TaMOC1突變體植株的靶位點序列處部分核苷酸序列發(fā)生了改變,造成其氨基酸序列發(fā)生了變化,進一步的定量PCR結(jié)果顯示TaMOC1的表達量明顯下調(diào)。下一步我們將對P_(TaMOC1-7D)::GUS轉(zhuǎn)基因T2代植株進行大量GUS染色及相關(guān)組織切片分析,進一步確定TaMOC1的表達模式。此外,我們將對pBUE411-TaMOC1-Cas9轉(zhuǎn)基因株系進行大田種植,分別對其冬前及拔節(jié)期分蘗情況、穗發(fā)育及結(jié)實情況進行觀察,確定TaMOC1對小麥分蘗的作用。
【圖文】：

圖 1-1 CRISPR 位點結(jié)構(gòu)圖Fig. 1-1 CRISPR site map/Cas 系統(tǒng)的工作原理物 RNA 干擾（RNAi）原理相似，CRISPR/Cas 系統(tǒng)，通過的表達被沉默（Zhang et al., 2016）。首先，CRISPR/Cas 系碼的蛋白的協(xié)助下，找到與間隔序列互補的外源 DNA 序列r）。原間隔序列的選取并不是隨機的，它的兩端都有幾個非常序列臨近基序的 PAM（protospacer adjacent motif，PAM）（ 通常由 NGG 三個堿基構(gòu)成（N 為任意堿基）（Feng et al., 2合物將原間隔序列從外源 DNA 剪切下來，并在其他酶的協(xié) 序列的前導(dǎo)區(qū)的下游（Liang et al., 2018）。隨后，，DNA 將打段新的間隔序列就被添加到了基因組 CRISPR 序列。然后，調(diào)控下合成 pre-CRISPR-derived RNA（pre-crRNA）和 tran

小麥 TaMOC1 基因的啟動子分析及 CRISPR-Cas9 突變體的獲得3 結(jié)果與分析3.1 TaMOC1-7A、TaMOC1-7B、TaMOC1-7D 的表達模式分析小麥 TaMOC1-7A、TaMOC1-7B、TaMOC1-7D 三個基因來源于不同的祖先，其表達模式可能存在差異。我們選取了幼根、幼葉、三葉一心時期的莖尖及小花小穗原基分化期的小穗原基為材料，對 TaMOC1-7A、TaMOC1-7B、TaMOC1-7D 分別了設(shè)計特異引物RTQPTaMOC1-7A-F/RTQPTaMOC1-7A-R 、 RTQPTaMOC1-7B-F/RTQPTaMOC1-7B-R 和RTQPTaMOC1-7A-F/RTQPTaMOC1-7A-R 通過半定量實驗對它們進行表達模式分析，結(jié)果顯示TaMOC1-7A、TaMOC1-7B、TaMOC1-7D 在根、莖尖、葉和小穗中的表達模式均有表達，其中在莖尖中 TaMOC1-7B 表達量最高（圖 3-1）。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2;S512.1

【參考文獻】

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