【摘要】：研究背景:房室傳導(dǎo)阻滯(atrioventricular block,AVB)是指房室交界區(qū)脫離生理不應(yīng)期后,心房沖動傳導(dǎo)仍延遲或未能傳導(dǎo)至心室,阻滯部位可為房室結(jié),希室束或束支等不同解剖水平。其中III度AVB是心臟傳導(dǎo)阻滯中最嚴(yán)重的一種,發(fā)生III度AVB時所有心房沖動均不能傳導(dǎo)至心室,引起完全的房室活動分離。對高血壓患者而言,心臟發(fā)生結(jié)構(gòu)重塑及電重塑使其AVB易感性增加。隨著分子遺傳學(xué)和生物信息技術(shù)的進(jìn)展,AVB的遺傳因素受到廣泛關(guān)注和重視。迄今為止,相繼有家系研究發(fā)現(xiàn)AVB相關(guān)致病性基因突變,此外也有全基因組關(guān)聯(lián)研究在SCN5A、SCN10A、CAV1、TBX5、ITGA9、ID2等基因上發(fā)現(xiàn)與PR間期相關(guān)的基因多態(tài)性。研究目的:探討國人SCN5A基因變異與高血壓合并III度AVB的相關(guān)性。研究方法:收集分析南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院高血壓合并III度AVB患者臨床資料,并將年齡、性別相匹配的高血壓患者作為對照組,抽取病例組和對照組的外周血提取全基因組DNA。使用一代測序法對SCN5A基因的外顯子及外顯子和內(nèi)含子的交界區(qū)進(jìn)行測序,序列比對篩查基因變異。之后,再采用Fisher's精確檢驗比較變異位點等位基因頻率在病例組與對照組(高血壓對照組、Ex AC數(shù)據(jù)庫東亞人群)中有無差異。與此同時,通過生物信息學(xué)方法分析基因變異的影響。針對錯義變異,采用Polyphen-2、Provean及Mutationtaster三種工具預(yù)測變異致病性,并采用ClusterX2.1軟件對位點保守性進(jìn)行分析。針對同義變異,通過生物信息學(xué)工具從轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及翻譯速度等方面評估變異的影響:采用RegRNA預(yù)測剪接位點、剪接調(diào)控原件位點及miRNA結(jié)合位點,mFold預(yù)測變異前后mRNA二級結(jié)構(gòu),Codon Usage Database數(shù)據(jù)庫查詢密碼子使用偏好。研究結(jié)果:本研究共納入病例組24例高血壓合并III度AVB患者及對照組83例高血壓患者,對上述患者進(jìn)行SCN5A基因測序及序列比對,發(fā)現(xiàn)五個已報道的SCN5A基因的單核苷酸變異:c.87AG(p.A29A,rs6599230),c.1673AG(p.H558R,rs1805124),c.1755CT(p.H585H,rs201024847),c.3578GA(p.R1193Q,rs41261344),c.5457TC(p.D1819D,rs1805126),病例組中上述變異的等位基因頻率分別為0.6952、0.0952、0.0048、0.0619和0.5810。上述變異的Fisher's精確檢驗結(jié)果及生物信息學(xué)分析結(jié)果如下:(1)錯義變異分析:Fisher's精確檢驗結(jié)果顯示兩個錯義變異c.1673AG及c.3578GA的等位基因頻率在病例組和對照組間無統(tǒng)計學(xué)差異。CluxterX2.1序列比對結(jié)果顯示變異氨基酸位點并非完全保守。致病性預(yù)測軟件Polyphen-2、Provean和Mutationtaster預(yù)測c.1673AG為無害變異;c.3578GA經(jīng)Polyphen-2、Provean預(yù)測為無害變異,而Mutationtaster預(yù)測其具有致病性。(2)同義變異分析:Fisher's精確檢驗結(jié)果顯示同義變異c.87AG及c.5457TC的等位基因頻率在病例組低于對照組,具有統(tǒng)計學(xué)差異,而c.1755CT無顯著差異。RegRNA預(yù)測顯示本研究中的三個同義變異(c.87AG、c.1755CT和c.5457TC)均不在剪接位點、剪接調(diào)控原件位點及miRNA結(jié)合位點上。運用mFOLD軟件,進(jìn)行變異前后的mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,結(jié)果顯示c.87AG變異后mRNA二級結(jié)構(gòu)較變異前存在明顯差異,其最小自由能降低,利于mRNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定;c.1755CT變異后mRNA最小自由能及二級結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象均無明顯改變;而c.5457TC變異前后二級結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象雖差別不大,但變異后mRNA最小自由能增加,不利于mRNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。采用Codon Usage Database數(shù)據(jù),查詢并比較變異前后密碼子使用的頻率,結(jié)果顯示c.87AG變異后的密碼子使用頻率低于變異前;c.1755CT及c.5457TC變異后密碼子使用頻率高于變異前。結(jié)論:(1)SCN5A基因變異c.87AG的等位基因頻率在病例組顯著低于對照組,變異后mRNA的二級結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,提示其可能為保護(hù)性變異。(2)本研究未發(fā)現(xiàn)c.1673AG變異與高血壓合并III度AVB存在相關(guān)性,而c.1755CT,c.3578GA,c.5457TC變異與高血壓合并III度AVB的相關(guān)性尚無明確支持依據(jù),為今后臨床基因篩查結(jié)果判別提供一定的理論依據(jù)。(3)基因多態(tài)性的致病性和保護(hù)性具有條件性作用,單一條件下往往不發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。
【圖文】：

碼基因（ITGA9）及 DNA 結(jié)合抑制因 2 編碼基因（ID2）[10-13]。1.3.2 SCN5A 基因與 III 度 AVB心臟鈉離子通道是由核心α亞基 Nav1.5 和輔助的β亞基的共同構(gòu)成的離子傳導(dǎo)孔道，廣泛分布于心肌細(xì)胞及心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)，其表達(dá)量在希氏-浦肯野系統(tǒng)中較高，而竇房結(jié)及房室結(jié)中相對較低。鈉通道在動作電位的 0 相（去極化期）大量開放，內(nèi)向的鈉離子電流（INa）形成動作電位的上升支（0 期），參與心肌細(xì)胞動作電位的產(chǎn)生和傳導(dǎo)。Nav1.5 即由 SCN5A 基因編碼，是完成功能的主要結(jié)構(gòu)，該亞基包括四個同源結(jié)構(gòu)域（DI-DIV），每一個結(jié)構(gòu)域又包括 6 個跨膜片段（S1—S6）。國內(nèi)外已有大量研究發(fā)現(xiàn) SCN5A 基因變異導(dǎo)致鈉離子通道功能異常，，可引發(fā)多種包括 AVB 在內(nèi)的多種心臟疾病。圖 1-1 為 Nav1.5 結(jié)構(gòu)示意圖，已標(biāo)出既往研究中發(fā)現(xiàn)的 AVB 相關(guān)突變位點（復(fù)合性突變及內(nèi)含子變異未標(biāo)出）。

xon28-3-F CTCATCGCCTACGTGATGAGTGxon28-3-R GCTCTAGTGACACTGTCATAG 酶鏈反應(yīng)（PCR）以下反應(yīng)體系（表 2-4）加樣至 96 孔板。表 2-4 PCR 反應(yīng)體系試劑 用量dd H2O 6.0 ul2×Master Mix 8.0ulPrimerF（上游引物） 0.5ulPrimerR（下游引物） 0.5ulDNA 1.0ul已加樣的 96 孔板放入 PCR 儀，設(shè)定并選擇反應(yīng)程序（圖 2。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R544.1;R541

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本文編號：2652481