【摘要】：本論文主要分成兩個(gè)部分:1.水稻OsbZIP81轉(zhuǎn)基因材料的構(gòu)建及其與OsIMPa4相互作用的初步探究;2.限制性內(nèi)切酶I-SceI的制備。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化,能將包含外源基因的T-DNA整合到水稻基因組中,并能穩(wěn)定遺傳。研究表明擬南芥基因AtIMPa4在T-DNA復(fù)合物入核,AtVIP1在T-DNA整合到基因組的過(guò)程中都發(fā)揮重要的作用,同時(shí)AtVIP1作為擬南芥bZIP轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)控下游基因響應(yīng)非生物脅迫。本研究對(duì)AtVIP1在水稻中的同源基因OsbZIP81展開了初步研究,結(jié)果如下:1.OsbZIP81屬于水稻bZIP轉(zhuǎn)錄因子第IX亞家族的基因,有三個(gè)轉(zhuǎn)錄本。通過(guò)同源比對(duì)AtVIP1與水稻bZIP第IX亞家族的基因,發(fā)現(xiàn)它們的bZIP結(jié)構(gòu)域都很保守,同時(shí)OsbZIP81與AtVIP1具有很高的氨基酸序列相似度。2.構(gòu)建了OsbZIP81的超表達(dá)與CRISPR敲除的轉(zhuǎn)基因水稻植株,發(fā)現(xiàn)在超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中OsbZIP81表達(dá)量明顯高于野生型,在CRISPR敲除轉(zhuǎn)基因植株中OsbZIP81的表達(dá)量則顯著降低。3.OsIMPa4是AtIMPa4在水稻內(nèi)的同源基因,酵母雙雜交以及BiFC結(jié)果顯示OsIMPa4與OsbZIP81的三個(gè)轉(zhuǎn)錄本蛋白都能相互作用。限制性內(nèi)切酶是分子生物學(xué)中一種非常重要的工具酶。I-SceI是釀酒酵母線粒體內(nèi)含子編碼的一種限制性內(nèi)切酶,它的識(shí)別位點(diǎn)為18個(gè)堿基的非回文序列,酶切后產(chǎn)生不對(duì)稱的粘性末端,并且在動(dòng)植物基因組中不含或只含有極少的酶切位點(diǎn)。因此I-Sce I適用于BAC文庫(kù)中大片段外源DNA的酶切檢測(cè)和不同載體之間大片段外源DNA的交換。本研究通過(guò)基因合成、克隆、表達(dá)、純化獲得重組蛋白GST-I-SceI,測(cè)得蛋白濃度是590 mg/L,通過(guò)酶切質(zhì)粒驗(yàn)證得到GST-I-SceI蛋白酶活是0.2 U/μL,GST-I-SceI比活約為340 U/mg。
【圖文】：

6圖 1 OsbZIPs 的進(jìn)化分析及 OsbZIP 蛋白結(jié)構(gòu)域的比對(duì)（Z. G. E et al 2014）A: OsbZIPs 的進(jìn)化分析 B: OsbZIP 蛋白結(jié)構(gòu)域的比對(duì)Fig. 1 phylogenetic analysis of OsbZIPs and domain alignment in OsbZIP proteins.（Z. G. E et al 2014）Panel A : phylogenetic analysis of OsbZIPs Panel B:domain alignment in OsbZIP proteins.

圖 3 OsbZIP81 基因三個(gè)轉(zhuǎn)錄本之間的關(guān)系Fig. 3 The relationship between three transcripts of OsbZIP81 gene從上圖中可以看出，OsbZIP81.1 與 OsbZIP81.3 的后半部分完全相同，但是bZIP81.1 與 OsbZIP81.2 在 3’端有 81bp 是不相同的。本研究重點(diǎn)是圍繞 OsbZIP OsbZIP81.2 這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本展開研究的。5.2 超表達(dá)載體的鑒定本研究將 OsbZIP81 的前兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本 OsbZIP81.1、OsbZIP81.2，，通過(guò)酶切酶超表達(dá)載體 pU1301-OsbZIP81.1-Flag、pU1301- OsbZIP81.2-Flag。圖 4 為用 Ba KpnI 分別雙酶切兩個(gè)重組超表達(dá)載體的電泳膠圖。酶切后的片段大小符合預(yù)
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 孫曉麗;李勇;才華;柏錫;紀(jì)巍;季佐軍;朱延明;;擬南芥bZIP1轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與ABRE元件結(jié)合調(diào)節(jié)ABA信號(hào)傳導(dǎo)[J];作物學(xué)報(bào);2011年04期

2 王蘭;田華;;根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年30期

3 曹明霞,衛(wèi)志明,黃健秋;根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化[J];植物生理學(xué)通訊;2002年05期

4 李衛(wèi),郭光沁,鄭國(guó)

本文編號(hào)：2648843